Значение Rf

Высушенная пластинка является хроматограммой исследуемых веществ. Одним из основных показателей в ТСХ является показатель R_f. Этот параметр является аналогией времени удерживания и зависит как от свойств разделяемых веществ, состава подвижной фазы и сорбента, так и от физических параметров.

Определение значения R_f проводят как отношение расстояния прошедшего веществом к расстоянию, прошедшего фронтом растворителя:

Значение R_f - величина безразмерная и имеет значение от 0 до 1.

На значение R_f не влияет расстояние пройденное фронтом растворителя.

На практике, в начале определяют расстояние прошедшее фронтом растворителя: от линии старта (а не от края пластинки) до места, где находился фронт в момент окончания хроматографирования (линия финиша). Затем определяют расстояние от линии старта до пятна разделенного вещества (до центра этого пятна). Во тут и оказывает влияние размер пятна! Ведь если пятно имеет круглую форму и небольшой размер, то полученное R_f имеет четкое значение. А если полученное пятно имеет большой размер или неправильную форму, то при определении R_f такого пятна, ошибка может достигнуть 0,1!

Цель работы: на примере кислотного гидролиза крахмала изучить процесс последовательной деполимеризации полисахарида. Провести хроматографический анализ гидролизата, идентифицировать продукты гидролиза.

Реактивы и оборудование:

1) крахмальный клейстер;

2) 10%-ный раствор серной кислоты;

3) 0,1 н раствор йода в KI;

4) пластинки «Силуфол» для ТСХ;

5) разделяющая система растворителей;

6) реагент для проявления пластинок;

7) вода дистиллированная;

8) стаканы химические на 50 мл;

9) штатив с калиброванными пробирками на 10 мл;

10) пипетки;

11) стеклянная палочка;

12) хроматографическая камера;

13) термостат;

14) весы лабораторные;

15) мерный цилиндр на 25 мл.

Порядок выполнения работы.

Опыт 1. Приготовление крахмального клейстера.

В химическом стакане растворяют 1,5 г крахмала в 25 мл дистиллированной воды и доводят до кипения при интенсивном перемешивании стеклянной палочкой.

Опыт 2. Гидролиз крахмала.

При нагревании крахмала с разбавленными кислотами происходит его гидролиз по следующей схеме:

(С₆Н₁₀О₅)_х  (С₆Н₁₀О₅)_y  С₁₂Н₂₂О₁₁  С₆Н₁₂О₆

крахмал декстрины мальтоза глюкоза

где у  х.

В мерную пробирку помещают 2 мл крахмального клейстера и 6 капель раствора серной кислоты. Содержимое пробирки встряхивают и ставят в стакан на 50 мл с кипящей водой. Каждые 2 минуты отбирают пипеткой каплю раствора и переносят в пробирку с раствором йода. Для этого предварительно в 8 пробирок помещают по одной капле раствора йода и 5 капель воды.

Последовательные пробы обнаруживают постепенное изменение окраски при реакции с йодом (синюю, сине-фиолетовую, красно-фиолетовую, красновато-оранжевую, оранжевую и желтую).

Крахмал с йодом дает синее окрашивание. Декстрины, в зависимости от величины цепочки, с йодом окрашиваются в фиолетовые, красные и оранжевые цвета. Мальтоза и глюкоза не изменяют окраски йода.

Гидролиз крахмала заканчивают, когда крахмальный клейстер не будет давать цветной реакции с йодом. Отмечают общую продолжительность гидролиза.

По окончании гидролиза проводят анализ реакционной среды методом ТСХ.

Опыт 3. Метод ТСХ.

На подготовленную пластинку для ТСХ «Силуфол» с помощью хроматографического шприца или капилляра наносят гидролизат в виде точки, рядом (с обеих сторон от точки гидролизата) наносят пробы свидетелей – раствор мальтозы и раствор глюкозы (при проведении исследований веществ с предполагаемым составом, применяют метод хроматографирования со свидетелем - известным веществом). Линию финиша отмечают, отступив 5 мм от верхнего края пластинки.

L =а-в (смотри рисунок), L0=а-б (смотри рисунок). Рисунок 1. Хроматограмма. Линия а-а – линия старта, б-б – линия фронта растворителя (линия финиша), в – линии, отвечающие центру пятен вещества. А – точка нанесения раствора глюкозы; Б – точка нанесения раствора гидролизата; В – точка нанесения раствора мальтозы.

Пластинку вертикально помещают в камеру, которая заполнена разделяющей смесью до высоты 5 мм. Состав разделяющей смеси: н-бутанол – уксусная кислота – вода (60 мл – 15 мл – 25 мл). Пластинку выдерживают в камере до тех пор, пока высота подъема фронта восходящего растворителя не достигнет отмеченной длины разделительного пути (линия финиша).

По окончании хроматографического разделения пластинку вынимают из камеры и сушат при комнатной температуре в вытяжном шкафу до полного испарения остатков растворителей.

Затем разделение повторяют в той же системе растворителей. Высушенные пластинки погружают в реагент, представляющий собой смесь: н-бутанол – водоуксусная кислота – фосфорная кислота – анилин – дифениламин (60 мл – 25 мл – 15 мл – 10 мл – 1 мл – 2 г). Пластинки снова сушат и проявляют в термостате при температуре 120⁰С в течение 5 мин.

Идентификацию продуктов гидролиза проводят с помощью свидетелей и по значениям R_f. Данные заносят в таблицу 3.

Таблица 3.

№ п/п	Название компонента смеси	Rf	Цвет пятна
1	Декстрины
2	Мальтоза
3	Глюкоза

Контрольные вопросы.

1. Роль моно-, олиго- и полисахаридов в пищевых продуктах.

2. В каких пищевых технологиях используется гидролиз полисахаридов?

3. Кислотный гидролиз крахмала. Какие продукты образуются при гидролизе? Недостатки кислотного гидролиза.

4. Гидролиз крахмала амилолитическими ферментами: - и -амилазами, глюкозоамилазой. Особенности ферментативного гидролиза крахмала.

5. Какую окраску с йодом дают крахмал, декстрины, мальтоза и глюкоза?

6. На чем основано хроматографическое разделение смеси веществ? Что такое элюент? Как рассчитывается величина R_f?

7. Приведите классификацию углеводов.

8. Охарактеризуйте восстанавливающие и невосстанавливающие дисахариды.

9. Приведите строение и гидролиз крахмала

10. Какова пищевая и энергетическая ценность углеводов.