Ізоелектрична точка білків

Як вже наголошувалося, заряд молекули білка залежить від реакції середовища і змінюється із зміною цієї реакції. Якщо збільшити або зменшити рН в розчинах, то можна зрівняти кислотні властивості білків з основними або навпаки — основні з кислотними. Наступає ізоелектричний стан (ІЕС), при якому від молекули білка відщеплюється стільки іонів Н⁺, скільки приєднується. Кількість позитивних зарядів в молекулі білка буде рівна кількості негативних. Водневий показник, при якому наступило ІЕС білка, називається ізоелектричною точкою (ІЕТ). Різні білки характеризуються неоднаковою ІЕТ .

Молекула білка неоднаково заряджає залежно від рН середовища. У середовищах, де концентрація іонів Н⁺ відповідає ІЕТ, кількість позитивних зарядів в молекулі білка рівна кількості негативних (I). У середовищах, де рН < ІЕТ, іони Н⁺ приєднуються до іонів карбоксильної групи, молекула білка заряджає позитивно (II). У середовищах, де рН > ІЕТ, молекула білка заряджена негативно (III):

H₃⁺N−R−COOH^- (I) H₃⁺N− R−COOH (II) H₂N −R−COO^- (III)

При ІЕТ частинки білка мають інші властивості, ніж при звичному стані. В умовах ІЕТ білки не мають електрофоретичної рухливості, характеризуються мінімальною стійкістю, розчинністю, гідратацією, в'язкістю, осмотичним тиском, електропровідністю, ступенем набухання, питомим оптичним обертанням і мембранним потенціалом. При ІЕТ відбувається найбільша коагуляція білкових розчинів і вони мають найвищу швидкість желатинування. При ІЕТ деяка частина молекули білка дисоціює, але молекула білка залишається електронейтральною, оскільки при цьому від неї відщеплюється і до неї приєднується однакова кількість іонів Н⁺ і ОН^-.

ІЕТ визначається прямими і непрямими методами. До прямих методів відносяться методи, при яких визначається рН розчину білка, коли рухливість частинок в постійному електричному полі рівна нулю (електрофоретичні методи). Непрямі методи засновані на встановленні рН розчину, коли наступає мінімальна величина в'язкості, набухання або максимальна величина каламутності і осадження білка.

Вивчення ІЕТ багатьох колоїдів організму людини і тварин представляє великий інтерес для діагностики захворювань і оцінки змін, що відбуваються в організмі, органах, тканинах, клітках і субклітинних структурах. Між ІЕТ, стабільністю колоїдів і інтенсивністю обміну речовин і енергії існує певна кореляція

Порушення стійкості розчинів вмс. Висолювання, коацервація Коагуляція розчинів високомолекулярних сполук

Розчини високомолекулярних речовин в термодинамічно рівноважному стані аналогічно істинним розчинам мають абсолютно агрегативну стійкістю. Висока стійкість колоїдних розчинів і високомолекулярних сполук визначається двома чинниками – наявністю на поверхні частинок двох оболонок: електричної і сольватної (гідратної). Для коагуляції колоїдів високомолекулярних сполук необхідно не тільки нейтралізувати заряд колоїдної частинки, але і зйнувати рідинну оболонку. Виділення високомолеку-лярних сполук із розчинів за своїм характером відрізняється від коагуляції типових гідрофобних колоїдів. Так, якщо для гідрофобних золей досить незначних добавок електроліту, щоб викликати коагуляцію, то для високомолекулярних речовин цього недостатньо. Для виділення дисперсної фази полімерів необхідні високі (аж до насичених розчинів) концентрації електролітів. Наприклад, яєчний глобулін виділяється при напівнасиченні розчину сульфатом амонію, а яєчний альбумін – лише при повному насиченні.

Явище виділення в осад розчиненого ВМС під дією великої концентрації електроліту одержало назву висолювання. До висолювання непридатне правило Шульце-Гарді, тому не можна ототожнювати висолювання з явищем звичної електролітної коагуляції. На відміну від гідрофобних золей явище висолювання високомолекулярних речовин не пов'язане з дзета-потенціалом колоїдних міцел і полягає у порушенні сольватного (гідратного) зв'язку між макромолекулами полімеру і розчинником, тобто, в пониженні розчинності полімеру. При введенні солі частину молекул розчинника, яка була в сольватному зв'язку з макромолекулами ВМС, сольватує молекули введеної солі. Чим більше буде введено солі, тим більше число молекул розчинника покине макромолекули полімеру і сольватує сіль. Таким чином, що висолююча дія солі полягає в її власній сольватації (гідратації) за рахунок десольватації (дегідратації) молекул високомолекулярних сполук.

Численні дослідження показали, що всякі сполуки, здатні сольватувати розчинником даного ВМС і знижувати його розчинність, буде придатним для висолювання. Так, спирт і ацетон здатні відмінно висолювати желатину з її водних розчинів. Аналогічно відбувається осадження спиртом білка з водного розчину або осадження ацетоном каучуку з розчину бензолу.

Враховуючи механізм осаждаючої дії електро-літів і інших десольватуючих речовин, Кройт в свій час запропонував загальну схему осадження високо-молекулярних речовин, яка представлена на рис. 2. З цієї схеми видно, що для осадження макромолекул необхідно видалити водну оболонку (спиртом або іншою дегідратуючою речовиною) і зняти заряд
	Рис. 2. Схема коагуляції (за Кротом)

її шляхом додавання електроліту. Причому послідовність цих операцій не має значення. Схема Кройта враховує тільки дію електролітів і де гідрату-ючих речовин, тобто зняття заряду і водної оболонки, але абсолютно не враховує специфічності цих речовин.

У ряді випадків для осадження багатьох високомолекулярних сполук (білків, полісахаридів) зняття заряду не є обов'язковою умовою, оскільки головним чинником їх стійкості служить гідратна оболонка, утримувана по-лярними, але не дисоційованими групами (ефірними і пептидними зв'язками, спиртними групами). Деякі високомолекулярні сполуки мають високу стійкість до висолювання. Наприклад, при засолці риби в розчин (розсіл) переходять значні кількості білкових сполук, які залишаються в ньому в стані золю, не дивлячись на те, що він є майже насиченим розчином солі. Така висока стійкість до висолювання пояснюється особливо сильною гідратацією білків.

Таким чином, при висолюванні високомолекулярних речовин вирішаль-ну роль виконує не зарядність іонів, а їх здатність до гідратації і до адсорбції на коллоїдно-дисперсних частинках.

За своєю висолюючою дією, усі катіони і аніони можна розташувати в ліотропні ряди





Розташування іонів в ліотропних рядах пов'язане не з величиною їх заряду, як у разі звичної коагуляції, а зі ступенем їх гідратації. Чим більше іон здатний зв'язувати розчинник, тим більше його дія, що висолює. Основна роль у висолюванні, як і в набуханні, належить аніонам, катіони ж надають меншу дію на висолювання.

Великий вплив на процес висолювання надає також і ступінь розчин-ності самого полімеру в даному розчиннику: чим вона нижча, тим повніше і швидше відбувається висолювання. У свою чергу розчинність полімерної сполуки залежить від довжини макромолекул і молекулярної маси полімеру: чим вони більше, тим менше розчинність даного полімеру, отже, тим легше він висолюється. На цьому принципі заснований метод так званого фракційного висолювання, мета якого полягає в послідовному висолюванні з розчину все зростаючими порціями висолювача окремих фракцій полімерів, починаючи з полімерів щонайвищого ступеня полімеризації (з найбільшою молекулярною масою). Так, на тонкому поєднанні дії спирту, солей і охолоджування до -5° засновані способи детального фракціонування білкових сумішей по Кону. З сироватки крові цим методом можна виділити понад 12 різних білків.

Для фракціонування застосовують також спосіб поступового пониження температури при постійному складі рідини. Препаратне розділення високомолекулярних сполук широко застосовується при наукових дослідженнях для характеристики полідисперсності полімерів.

Як показали дослідження, високомолекулярні сполуки, виділені з розчину висолюванням, після відмивання їх від електролітів можуть бути знову переведені в розчин (явище оборотнє). Колоїди, які при усуненні чинника, що викликав коагуляцію, здатні переходити із стану гелю в стан золя, носять назву оборотних колоїдів. Проте високомолекулярні сполуки можуть за певних умов осідати і необоротно. Таке необоротне осадження високополімерів, зокрема білків, під впливом високої температури, при дії концентрованих кислот і лугів, дубильних речовин, променистій енергії називається денатурацією. При денатурації відбувається не тільки осадження полімерів, але і зміна їх хімічної природи. Білки при денатурації стають нерозчинними і в більшості випадків втрачають здібність до набухання.

Висолювання має велике практичне значення в цілому ряду технологічних процесів, наприклад, в миловарінні, у виробництві фарбників, каніфолі і багатьох інших штучних волокон.