Молекулярная биология клетки Глава 1

21

леозидмонофосфат) входит в состав полинуклеотидной цепи. Трифосфатные эфиры (нуклеозидтрифосфаты) участвуют в биосинтезе ДНК.

•Нуклеозиды — N гликозильные производные (N гликозиды) разных азотистых оснований (пурины, пиримидины), содержащих дезоксирибозу в молекуле дезоксирибонуклеиновой кислоты или рибозу в молекуле рибонуклеиновой кислоты. Нуклеозиды — дезоксиаденозин, дезоксигуанозин, дезоксицитидин, дезокситимидин, уридин (в молекуле РНК).

•Пуриновые основания — аденин (A) и гуанин (G).

•Пиримидиновые основания — цитозин (C), тимин (T) и урацил (U), присутствующий только в молекуле РНК.

•Полинуклеотидная цепь. При помощи фосфодиэфирных связей нуклеотиды образуют полинуклеотидную цепь, при этом ковалентные фосфодиэфирные связи соединяют 5’ атом углерода присоединяющегося нуклеотида с 3’ атомом углерода нуклеотида растущей цепи (рис. 1-6).

•Двойная спираль ДНК. Две антипараллельные (5’-конец одной цепи располагается напротив 3’-конца другой) комплементарные цепи полинуклеотидов, соединённые водородными связями в парах A–T и G–C, образуют двухцепочечную молекулу ДНК. Молекула ДНК спирально закручена вокруг своей оси. На один виток ДНК приходится приблизительно 10 пар оснований.

•Смысловая цепь ДНК. Последовательность нуклеотидов в цепи кодирует наследственную информацию.

•Антисмысловая цепь по сути является копией смысловой цепи ДНК. Служит матрицей для синтеза мРНК (информацию о первичной структуре белка), тРНК, рРНК, регуляторной РНК.

Хранение и реализация генетической информации (транскрипция → процессинг → трансляция → посттрансляционная модификация), а также ряд других функций ядра происходят при участии ядерной ДНК и разных видов РНК. Ядерная ДНК содержит гены — специфические последовательности нуклеотидов, несущие информацию о белках и РНК. Гены человека занимают всего 3% от всей ДНК; более 90% ДНК выполняет регуляторнуюфункцию. Количество генов, обнаруженных в геноме человека, составляет примерно 24000.

22

ПРАКТИЧЕСКИЕ НАВЫКИ

I. СВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ. ПРАВИЛА РАБОТЫ С ПРЯМЫМ СВЕТОВЫМ МИКРОСКОПОМ

Установка прямого светового микроскопа в рабочее положение

Микроскоп переносят двумя руками, поддерживая правой рукой тубусодержатель и левой рукой — основание. Чтобы не выпал окуляр, микроскоп всегдадолжен находиться в вертикальном положении. Микроскоп ставят настол, располагая его зеркалом в сторонуисточникасвета.

Для приведения микроскопа в рабочее положение необходимо проделать следующие операции.

1.Осторожно вращая револьвер, плавно подвести под тубус объектив малого увеличения (8х). Правильная установка объектива под тубусом определяется фиксатором, расположенным внутри револьвера.

2.Вращая макровинт, поставить объектив над отверстием предметного столика на расстоянии 1,5–2 см от плоскости предметного столика.

3.Поднять конденсор и открыть диафрагму.

4.Хорошо осветить полезрения, смотря левым глазом в окуляр, вращая зеркало с вогнутой поверхностью по направлению к источнику света до появления равномерного освещения. Правый глаз при этом должен быть открыт.

Работа при малом увеличении (объектив 8х)

Перед исследованием микропрепарат рекомендуется рассмотреть невооружённым глазом (ad oculi) и определиться срасположением объекта на предметном стекле. Далее следует выполнить следующие операции.

1.Положить на предметный столик микропрепарат покровным стеклом вверх так, чтобы объектив находился непосредственно над объектом.

2.Вращением макровинта опустить объектив на расстояние примерно 0,5 см от препарата. За перемещением объектива наблюдать сбоку, наклонив голову на уровне предметного столика.

3.Смотря в окулярлевым глазом, вращением макровинтаксебе медленно поднять тубус до появления четкого изображения объекта. Фокусное расстояние при данном увеличении составляет примерно 1 см.

4.Изучить препарат, рассматривая его одним глазом, стараясь при этом не закрывать второй глаз.

23

Работа при большом увеличении (объектив 40х)

К изучению микропрепарата при большом увеличении переходят после его визуализации при малом увеличении. Для этого необходимо проделать следующее.

1.Центрировать микропрепарат. Для этого изучаемое место микропрепарата нужно выставить под малым увеличением в центр поля зрения, посколькупри большом увеличении будет виден лишь центральный участок видимого при малом увеличении микропрепарата. При этом следует помнить, что микроскоп даёт перевёрнутое (обратное) изображение.

2.Слегка приподнять тубус, вращая макровинт на себя.

3.С помощью револьвера заменить объектив малого увеличения (8х) на объектив большего увеличения (40х).

4.Подвизуальным контролем (глядя сбоку) и вращая макровинт от себя, опустить тубус с объективом почти вплотную к препарату, но не до соприкосновения с покровным стеклом.

5.Глядя в окуляр, вращением макровинта на себя очень медленно поднимать тубус до появления изображения. Фокусное расстояние при объективе 40х составляет примерно 1 мм. При слишком быстром вращении винта изображение объекта можно легко пропустить.

6.После появления изображения дальнейшую фокусировку осуществляют микрометрическим винтом, вращая этот винт на пол оборота вперед или назад, но не поворачивая его полностью.

7.Рассмотреть микропрепарат, слегка вращая микровинт влево или вправо. Этим достигается возможность рассмотрения структур на разной глубине объекта, что обусловлено толщиной микропрепарата (среза).

8.После окончания изучения микропрепарата тубус слегка приподнять вверх при помощи макровинта.

9.Объектив 40х заменить на объектив 8х.

10.Снять микропрепарат с предметного столика.

Завершение работы с микроскопом

Закончив микроскопирование, следует проделать следующее.

1.Убрать микропрепарат с предметного столика.

2.Установить объектив с малым увеличением.

3.Вращением макровинта опустить объектив на расстояние до 1–2 см от предметного столика.

4.Держа одной рукой тубусодержатель, а другой поддерживая снизу основание, перенести микроскоп в место его хранения.

24

Проблемы, возникающие при микроскопировании

Часто встречающиеся проблемы, возникающие при самостоятельной работе с микроскопом, и способы их устранения представлены в таблице 1-3.

Таблица 1-3. Возможные проблемы и способы их решения при микроскопировании

25

Мазок крови лягушки

При малом увеличении микроскопа рассмотрите препарат крови лягушки. В поле зрения преимущественно видны эритроциты. С помощью револьвера замените объектив малого увеличения (8х) на объектив большего увеличения (40х) и изучите строение эритроцита крови лягушки. Эритроцит лягушки имеет вытянутую овальную форму, цитоплазма окрашена в розовый цвет. В центреклетки располагается крупное овальное ядро синего цвета (рис. 1-8).

Зарисовать эритроцит и обозначить: 1) ядро, 2) цитоплазму, 3) клеточную мембрану.

Рис. 1-8. Мазоккрови лягушки.

II. МИКРОПРЕПАРАТЫ. ОСОБЕННОСТИСТРОЕНИЯЯДЕР И ЯДЕРНЫХ СТРУКТУР В РАЗНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ТИПАХ

1. Клеточная культура фибробластов

Название клетки произошло от лат. fibra — волокно и греч. blastos — зародыш; т.е. клетка, образующая волокна. При изучении микропрепарата под малым увеличением видны плоские отростчатые клетки различной формы (от веретеновидной до звёздчатой) (рис. 1-9). Ядро крупное, овальной формы, имеет базофильное (синее) окрашивание. Базофильный краситель (гематоксилин) синего цвета связывается с кислотами (ДНК и РНК), окрашивая ядро. При большем увеличении на фоне преимущественно диспергированного хроматина (эухроматин) хорошо заметны 1–2 ядрышка. Строение ядрафибробласта характерно для клет-

26

Рис. 1-9. Схематическое строение (А) и микропрепарат (Б) фибробласта. Фибробласт (активная форма клетки) содержит хорошо выраженные органеллы: гранулярную эндоплазматическую сеть, комплекс Гольджи, митохондрии. Крупное овальное ядро с выраженным ядрышком занимает центральное положение вдоль продольной оси клетки. Фибробласт образует длинные отростки.

ки с интенсивной синтетической активностью, на что также указывает присутствие и других органелл. Цитоплазма содержит в большом количестве цистерны гранулярной эндоплазматической сети, хорошо выраженный комплекс Гольджи, многочисленные секреторные гранулы и митохондрии. Фибробласт активно синтезирует белки межклеточного матрикса, например, коллаген для образования коллагеновых волокон.

27

2.Мазок крови человека

Вмазке крови хорошо различимы: эритроциты (безъядерные клетки, имеющие формудвояковогнутого диска), ядерные шарообразные лейкоциты (лимфоциты, моноциты, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы) и тромбоциты (двояковыпуклые пластинки). При малом увеличении всё поле зрения занимают эритроциты, среди которых встречаются единичные лейкоциты. Для детального изучения клетоккрови применяют большое увеличение (рис. 1-10).

Эритроцит. Из-за высокого содержания щелочного белка гемоглобина (Hb) клетка окрашена в розовый цвет кислым красителем эозином (ацидофилия). Слабое окрашивание центральной части клетки обусловлено формой эритроцита (двояковогнутый диск). Ядро отсутствует.

Рис. 1-10. Клетки крови. Верхняя панель. А— эритроцит; Б — нейтрофил; В — лимфоцит; Г — моноцит [по Lentz T.L., 1971]. Нижняя панель. Препарат мазка крови человека.

28

Лейкоциты

•Лимфоцит. Базофильное ядро сферическое или с небольшой боковой выемкой; преимущественно содержит плотно сконденсированный хроматин. Ядро лимфоцита занимает почти весь объём клетки, так что цитоплазма окружает клетку в виде узкого кольца.

•Нейтрофил. Ядро имеет дольчатое (сегментированное) строение — 3–5 сегментов, соединённых перемычкой. Конденсированный хроматин расположен вдоль внутренней поверхности ядерной мембраны, эухроматин занимает центральную область дольки.

•Моноцит — самая крупная клетка крови. Базофильное ядро подковообразной (бобовидной) формы расположено эксцентрично, имеет пятнистый вид из-за неравномерно распределённого конденсированного и неконденсированного хроматина.

III. ЛАБОРАТОРНАЯРАБОТА. ПОЛОВОЙ ХРОМАТИН

Половой хроматин (тельце Барра) — конденсированный хроматин (гетерохроматин), содержащий ДНК одной из двух Х-хромосом в ядрах клеток женского организма. В медицинской практике при экспресс-ди- агностике половой хроматин определяют в эпителиальныхклетках слизистой оболочки щеки или в мазке периферической крови. В ядрах эпителиальных клеток половой хроматин выявляется в виде компактной глыбки хроматина, называемой тельцем Барра. В лейкоцитах периферической крови половой хроматин выявляется в виде «барабанных палочек» — глыбок хроматина, связанных тонкой нитью с ядром клетки. Исследование полового хроматина, кроме половой принадлежности, позволяет также установить аномалии в числе Х-хромосом (рис. 1-11).

Рис. 1-11. Половой хроматин в ядре эпителиальной клетки слизистой оболочки щеки человека. А— мужчина (46ХY); Б — женщина

(46ХХ). Овальной формы (0,7–1,2 мкм) тельце Барра локализуется рядом с внутренней ядерной мембраной.

29

Выявление полового хроматина в эпителиальных клетках слизистой оболочки щеки женского организма

•Протокол приготовления микропрепарата.

1.Осторожно несколько раз надкусить слизистую оболочку щеки и тщательно прополоскать рот питьевой водой.

2.Стерильным шпателем соскоблить эпителий и нанести содержимое соскоба тонким слоем на предметное стекло.

3.До высыхания материала на мазок нанести 1-2 капли гистологического красителя (ацетоорсеина) и накрыть мазок покровным стеклом.

4.Через 5-6 секунд окрашивания краситель удалить. Для этого покровное стекло накрыть кусочком фильтровальной бумаги и двумя большими пальцами умеренно надавить на покровное стекло.

5.Центрировать препарат под малым увеличением. Изучить препарат с помощью иммерсионного объектива.

•При изучении препарата нужно учитывать следующее:

1.клетка должна иметь овальное или округлое, слегка окрашенное ядро;

2.ядерная мембрана должна быть четкой, ненарушенной;

3.ядра не должны перекрывать друг друга;

4.только тёмноокрашенные тельца, находящиеся в контакте с ядерной мембраной, нужно расценивать как половой хроматин, или тельце Бара;

5.исследуют примерно 100 окрашенных ядер. В норме половой хроматин встречается в 30—40% ядер.

•Записать ход работы в рабочей тетради. Зарисовать эпителиальные клетки слизистой оболочки щеки с половым хроматином и без полового хроматина. На рисунках отметить следующее:

1.эпителиальная клетка;

2.ядро;

3.половой хроматин (тельце Барра).

•Сформулировать выводы лабораторной работы и ответить на следующие вопросы:

1.Что представлено в виде глыбки полового хроматина?

2.Почему в клетках мужчин, как правило, тельце Барра отсутствует?

30

ТИПОВЫЕТЕСТОВЫЕВОПРОСЫ

Пояснение. За каждым из перечисленных вопросов или незаконченных утверждений следуют обозначенные буквой ответы или завершения утверждений. Выберите один ответ или завершение утверждения, наиболее соответствующее каждому случаю.

1.Ядро. Верно всё, КРОМЕ:

(А)обеспечивает хранение и реализацию генетической информации

(Б) кодирующая ДНК занимает 3% от ядерного генома

(В) содержит примерно 24000 генов

(Г) наследственную информацию кодирует смысловая цепь

(Д) ДНК находится в кольцевой форме

2.Строение ядра. Верно всё, КРОМЕ:

(А)ядерная оболочка образована внутренней и наружной ядерными мембранами и ядерной пластинкой

(Б) в организации ядрышка участвуют петли аутосом

(В) ядерные частицы нуклеоплазмы — ферменты синтезаДНК и РНК

(Г) форма зависит от формы клетки

(Д) половой хроматин — конденсированная Х-хромосома женского организма

3. Молекула ДНК. Верно всё, КРОМЕ:

(А) состоит из смысловой и антисмысловой спирально закрученных полинуклеотидных цепей

(Б) антипараллельные цепи полинуклеотидов соединены фосфодиэфирными связями

(В) полинуклеотидная цепь представляет собой биополимер, состоящий из дезоксинуклеотидмонофосфатов

(Г) наследственную информацию кодирует смысловая цепь

(Д)антисмысловая цепь служит матрицей для синтеза мРНК

4.Ядерная пластинка. Верно всё, КРОМЕ:

(А)отделяет внутреннюю ядерную мембрану от содержимого ядра

(Б) состоит из белков промежуточных филаментов — ламинов

(В) участвует в организации ядерной оболочки

(Г) формирует перинуклеарный хроматин

(Д) участвует в синтезе белков, поступающих в перинуклеарные цистерны

5.Комплекс ядерной поры. Верно всё, КРОМЕ:

(А)встроен во внутреннюю ядерную мембрану

(Б) содержит белок-рецептор, контролирующий перенос белковых молекул из цитоплазмы в ядро

(В) рецептор ядерной поры может увеличивать диаметр канала поры