Молекулярная биология клетки Глава 1

11

Таблица 1-2. Сравнительные характеристики прямого светооптического и стереоскопического микроскопов

го с одной стороны плоское, с другой — матовое стекло. Иногда к микроскопу придается трансформатор и осветитель с коллектором.

К механической системе относят штатив, предметный столик, 2 окулярные трубки, кремальеры (винты для регулировки резкости), рукоятку переключения со шкалой, на которой нанесены цифры увеличения объектива.

Главное отличие стереоскопического микроскопа от микроскопа с плоским двухмерным изображением заключается в принципе построения оптической схемы для наблюдения объекта двумя глазами. Изображение формируется на основе бинокулярного зрения, позволяющего воспринимать объект в трёхмерном пространстве. Для получения трёхмерной геометрической проекции изображения оптическая схема стереоскопического микроскопа (схема по Грену или схема по Аббе) позволяет изучать объект под двумя разными углами, где каждый угол формирует свой поток света, свою ветвь наблюдения в одном и том же поле зрения. Для получения прямого действительного изображения объекта в оптическую схему микроскопа также включены оборачивающие призменные или линзовые системы.

Специальные виды световой микроскопии

Темнопольная микроскопия. Лучи от осветителя падают на объект сбоку, а в оптическую систему микроскопа поступают только рассеянные лучи. Наблюдаемый объект выглядит как освещённый на тёмном

12

поле. Темнопольная микроскопия позволяет исследовать, например, неокрашенные живые одноклеточные организмы.

Фазово-контрастная микроскопия применяется для исследования прозрачных (неокрашенных) биологических объектов, структуры которых имеют разную оптическую плотность. Для фазово-контрастной микроскопии применяются специальные окуляры и конденсор, или специализированный фазово-контрастный микроскоп.

Поляризационная микроскопия — метод исследования объекта в поляризованном свете с помощью специализированного микроскопа, предназначена для формирования изображения неокрашенных анизотропных структур (например, коллагеновые волокна и миофибриллы).

Интерференционная микроскопия — метод интерференционного контраста, основанный на интерференции световых волн, прошедших через неокрашенный объект. Специальная интерференционная оптика (оптика Номарского) применяется в микроскопах с дифференциальным интерференционным контрастом.

Люминесцентная микроскопияприменяется для обнаружения флюоресцирующих (люминесцирующих) объектов.В люминесцентном микроскопе свет от мощного источника проходит через два фильтра. Один фильтр задерживает свет перед образцом и пропускает свет длины волны, возбуждающей флюоресценцию образца. Другой фильтр пропускает свет длины волны, излучаемой флюоресцирующим объектом. Таким образом, флюоресцирующиеобъекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра.

КЛЕТОЧНОЕ ЯДРО

К надцарству (домену) эукариот принадлежат животные, растения и грибы, клетки которых, в отличии от прокариот (надцарство безъядерных клеток — бактерии и археи), имеют ядро. Ядро содержит наследственную информацию, закодированную в молекуле ДНК. В ядре происходит удвоение (репликация) молекул ДНК при делении клетки (митозе и мейозе) и синтез (транскрипция) РНК на молекуле ДНК. Синтез рибосомальной РНК и образование субъединиц рибосом происходит в специализированной структуре ядра — ядрышке.

Ядро (nucleus) — самая крупная органелла эукариотической клетки диаметром от 3 до 10 мкм. Ядро может быть различной формы (например, округлое, овальное, палочковидное, бобовидное, сегментированное). Как правило, клетка имеет одно ядро, однако встречаются двуядерные (клетки печени) и многоядерные клетки (остеокласты — макрофаги

13 костной ткани), а также многоядерные структуры (поперечно-полоса-

тое скелетное мышечное волокно). Эритроциты млекопитающих в ходе эволюции утратили ядро.

Ядро состоит из хроматина, ядрышка и нуклеоплазмы, окружённых ядерной оболочкой.

Хроматин

Термином «хроматин» обозначают комплекс ядерной двуцепочечной ДНК с белками (гистоны, негистоновые белки). Хроматин представлен хроматиновыми волокнами диаметром 11 нм, состоящими из сферическихструктурныхединиц — нуклеосом (рис. 1-2). Гистоны(H2A, H2B, H3 и H4) в составе нуклеосом содержат большое количество положительно

Рис. 1-2. Организация хроматина. В неконденсированном хроматине двойная спираль ДНК лежит на поверхности октамера гистонов (две копии гистонов H2A, H2B, H3 и H4), образуя нуклесомы. Нуклеосомы, разделённые интервалами в 200 пар оснований, формируют хроматиновые волокна диаметром 11 нм. В конденсированном хроматине дополнительно присутствует гистон H1, соединяющий нуклеосомы с образованием хроматиновых волокон диаметром 30 нм. Во время митоза хроматин полностью конденсируется, формируя видимые хромосомы [из: WidnellC.C., Pfeninger K.H., 1990 и Trifonov E.N., 1981].

14 заряженных аминокислот аргинина и лизина, что увеличивает аффиность

гистонов к отрицательно заряженной ДНК. Соотношение ДНК и белков в хроматине составляет 1:1. Различают гетеро- и эухроматин.

•Гетерохроматин — транскрипционно неактивный, конденсированный хроматин интерфазного ядра. При световой микроскопии выявляется в виде базофильных глыбок, на электронограммах — как скопление плотных гранул. Располагается преимущественно по периферии ядра и вокруг ядрышек, составляет 10% от общего хроматина. Типичный пример гетерохроматина — тельце Барра. Во всехсоматических клетках генетически женского организма одна из X-хромосом инактивирована и известна как половой хроматин (тельце Барра).

•Эухроматин — менее конденсированная (диспергированная) часть хроматина, локализуется в более светлых участках ядра между гетерохроматином. Эухроматин составляет 90% от общего хроматина, где 10% — транскрипционно активная часть и 80% — неактивная.

Ядрышко

Ядрышко (nucleolus) — округлой формы тельце диметром 1—5 мкм. Оно не является самостоятельной органеллой; это компактная структура в ядре интерфазных клеток, содержащая петли ДНК 13, 14, 15, 21 и 22 хромосом (рис. 1-3). Плотный фибриллярный компонент (parsfibrosa) состоит из транскрипционно активных участков ДНК. Гранулярный компонент (pars granulosa) содержит незрелые предшественники рибосомных субъединиц (СЕ). Основные функции ядрышка — синтез рРНК (транскрипция и процессинг рРНК) и образование СЕ рибосом. В клетке может быть от 1 до 5.

При помощи РНК-полимеразы I на ДНК-матрице синтезируется 45Sпредшественник рРНК. Далее 45S-предшественник рРНК взаимодействует с рибосомными белками с последующим разделением на 28S, 18S и 5,8S рРНК. Рибонуклеопротеины, содержащие 28S и 5,8S рРНК, затем объединяются с 5S РНК, синтезирующейся вне ядрышка, и образуют большую СЕ рибосомы. Рибонуклеопротеины, содержащие 18S рРНК, формируют малую СЕ рибосомы (рис. 1-4).

Ядерная оболочка

Ядерная оболочка состоит из внутренней и наружной ядерной мембраны и ядерной пластинки.

•На поверхности наружной ядерной мембраны расположены рибосомы, где синтезируются белки, поступающие в перинуклеарную цистерну.

15

Рис. 1-3. Строение и функция ядрышка. А — Ядрышко содержит петли ДНК 13, 14, 15, 21 и 22 хромосом. Б — Транскрипция рибосомальной РНК происходит в ядрышковых организаторах, которые содержат кодирующие рРНК сотни одинаковых генов, расположенных друг за другом. Рибонуклеиновые нити перпендикулярно отходят от ДНК, формируя структуры, напоминающие ветви ёлки. РНКполимераза I обеспечивает транскрипцию 45S-предшественника рРНК (5S РНК транскрибируется вне ядрышка) [по Dudek R.W., 2004].

•Перинуклеарная цистерна локализуется между наружной и внутренней мембранами, шириной в 20–40 нм. В местахслияния двух мембран расположены ядерные поры.

•Внутренняя ядернаямембранаснаружиграничитсперинуклеарной цистерной, изнутри отделена от содержимого ядра ядерной пластинкой.

•Ядерная пластинка толщиной 80–300 нм содержит белки промежуточных филаментов — ламины A, B и C, участвует в организации ядерной оболочки и перинуклеарного хроматина.

◊Мутация гена, кодирующего ламин А, вызывает прогерию Хат- чинсона-Гилфорда. Заболевание приводит к смерти к 13 годам от ускоренного старения.

17

Гранулы комплекса ядерной поры

Рис. 1-5. Комплекс ядерной поры в оболочке ядра образован 8 белковыми гранулами, расположенными по краю поры и соединяющими внутреннюю и наружнуюядерные мембраны. Часто в центре поры находится вновь образованная субъединица рибосомы, переносимая из ядра в цитоплазму [из StevensA., Loewe J., 1992].

Нуклеоплазма

Нуклеолазма заключена в ядерную оболочку, состоитиз ядерного матрикса (рибонуклеопротеиновая сеть) и ядерных частиц (ассоциатов разных молекул — АТФазы, ГТФазы, НАД-пирофосфатазы, ДНК- и РНКполимеразы, факторов транскрипции, ядерных рецепторов).

Ядерная ДНК

Молекула ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) состоит из двух (смысловой и антисмысловой) спирально закрученных полинуклеотидных цепей (рис. 1-6). Полинуклеотидная цепь представляет собой биополимер, состоящий из нуклеотидов. Нуклеотид образует остаток фосфорной кислоты, присоединённый по 5'-положению к сахару дезоксирибозе, который через гликозидную связь (C–N) по 1'-положению связан одним из четырёх азотистых оснований (рис. 1-7).

•Нуклеотиды — фосфатные эфиры нуклеозидов. Нуклеотиды существуют в виде моно-, ди- и трифосфатов. Монофосфатный эфир (нук-

18

Рис. 1-6. Молекула ДНК. Две полинуклеотидные цепи закручены одна вокруг другой в виде двойной спирали. По правилу Уотсона–Кри- ка (комплементарного спаривания нуклеотидов) две антипараллельные полинуклеотидные цепи соединены водородными связями в парахA–T и G–C. Пара A–T связана двумя, а пара G–C — тремя водородными связями [из Garrett R.H., GrishamC.M, 2007].

Аденин (6-амино пурин),

Гуанини (2-ами- но-6-окси пурин)

Пуриновые основания

19

Фосфодиэфирная связь

Фосфорная кислота

Дезоксиаденозинмонофосфат

(дАМФ)

Дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ)

Рис. 1-7. Молекулы, участвующиев синтезе ДНК. [из Garrett R.H., GrishamC.M, 2007].

20

Тимин

Гуанин

Цитозин

Аденин

Основание + дезоксирибоза = дезоксинуклеозид Основание + дезоксирибоза + фосфат = дезоксинуклеозидтрифосфат

Рис. 1-8 Полинуклеотид. Ковалентные фосфодиэфирные связи соединяют 3’-атом углерода дезоксинуклеозидмонофосфата полинуклеотидной цепи с5’-атомом углерода свободного дезоксинуклеозидтрифосфата. [из Garrett R.H., GrishamC.M, 2007].