Osnovy_vzaimodejstviya_ultrazvuka_s_biologicheskimi_obektami

Десорбция с поверхности клеток под действием ультразвука некавитационных интеисивностей (0,05..0,3 Вт/см2; 1 МГц; 5...60 мин) молекул белков, гликопротеинов и, возможно, других биополимеров подтверждается изменениями энзиматической активности поверхности эритроцитов, потерей эритроцитами, лимфоцитами и соматиче- скими клетками человека антигенов, связанных с их мембранами, повышением адгезивных свойств клеток, появлением в супернатанте заметных количеств гликопротеидов.

В результате ультразвукового облучения (0,05 Вт/см2; 0,88 МГц) суспензии эритроцитов (17000 кл./мм3) в физиологическом растворе в первую же минусу с поверхности каждой клетки десорбируется примерно 2 • 10-14г вещества белковой природы (для сравнения: масса

эритроцита - 10 -10г). Как видно из рис. 3.5, дальнейшее облучение не приводит к повышению в среде концентрации десорбированного вещества, по-видимому, благодаря достижению равновесия десорбция - резорбция. После прекращения ультразвукового облучения «смытые» макромолекулы быстро сорбируются на поверхности клеток, и через несколько минут идентифицировать белок в среде спектрофотометрически не удастся.

Поверхность клетки покрыта слоем фибриллярного белка, к которому, как правило, прикрепляются белковые глобулы, мукополисахариды и другие биомакромолекулы. Благодаря белковому покрытию межфазное натяжение между клеточной мембраной и окружающей средой составляет всего (0,1...2) • 10-3Дж/м2. Белковые молекулы, способные взаимодействовать и с липидами мембран, и с окружающей средой, ведут себя как поверхностно-активные вещества.

Межфазное натяжение на границе липид-вода составляет около 30 • 10-3 Дж/м2, и молекулы белка, обладая поверхностной активностью, стремятся адсорбироваться на этой поверхности, снизить межфазное натяжение, а следовательно, и свободную энергию поверхности.

Если клеточные мембраны после ультразвукового воздействия сохранили свою структурную целостность, то их функциональные характеристики восстанавливаются в течение 10...60 мин. Это восстановление, по-видимому, обеспечивается как функционированием специфических репаративных механизмов, так и процессами резорбции на поверхности мембраны белковых молекул, «смытых» микропотоками. Для заметною снижения межфазного натяжения на поверхности раздела между слоем липидов и белковым раствором должно адсорбироваться довольно много белка, поскольку его поверхностная активность невелика.

Рис. 3.5. Зависимость количества десорбироваиного с поверхности эритроцитов вещества белковой природы (поглощение надосадочной жидкости при 280 им) от времени воздействия ультразвуко м (0,1 Вт/см2)

О низкой поверхностной активности биомакромолекул свидетельс твует известный факт: статическое (установившееся) поверхностное натяжение плазмы кр ови, содержащей 7...8 % белка, на границе с воздухом всего лишь на 20...25 H/м ниже, че м у воды. Время формирования межфазной поверхности может составить десятки минут, так как коэффициент диффузии к рупных белковых молекул в водных растворах относительно мал, что существенно ограничивает скорость их сближения с поверхностью.

Если измерить поверхностное натяжение раствора белка на обновляющейся поверхности, например, в потоке или на поверхности капли, формирующейся на конце пипетки, то значение этого динамического поверхностного натяжения практически не будет отли- чаться от значений, характерных для поды. Присутствие в среде ми кропузырьков газа резонансных размеров значительно увеличивает эффективность ультразвукового воздействия на клеточну ю поверхность.

В модельном эксперименте вблизи погруженной в воду гидрофобной мембраны с порами диаметром 3,2 мкм, в которых стабилизированы газовые пузырьки, необратимая агрегация тромбоцитов наблюдается под действием ультразвука (1 МГц) с интенсивностью 32 мВт/см2. Если интенсивность не превышает 30 мВт/см2, агрегация обратима.

Эффект обусловлен микропотоками вблизи тромбоцитов, очень чувствительных к сдвиговым усилиям. Тро мбоциты начинают агрегировать, если напряжение сдвига достигает всего 5 Н/м2.

В этих же условиях из эритроцитов высвобождается АТФ, что можно фиксировать но свечению люциферин-люциферазного комплекса, добавленного в суспензию. Порог этого явления также лежит в области 20...30 мВт/см2. В отсутствии пузырьков газа или при более низких интенсивностях ультразвука эффекты не наблюдаются.

Значительно слабее дейст вует ультразвук на двухслойные липидны е мембраны, лишенные белкового покрытия. Долго не удавалось обнаружить изменений в электроемкости, проводимости или разности потенциалов искусственной мембраны, облучаемой ультразвуком с частотой 1 МГц и интенсивностью в ин тервале 0,1...4 Вт/см2. Более высокие интенсивности ультразвука приводят к фрагментац ии мембран. Однако ультразвук (0,6 Вт/см2; 0,88 МГц) в определенных условиях значит ельно - на 60... 100 % -

увеличивает электропроводность двухслойных липидных мембран и их проницаемость по отношению к ряду ионов, а также ускоряет встраивание каналообразующего антибиотика нистатина в матрицу мембран, что может быть обусловлено как из менениями механических свойств матрицы, так и нарушениями в прилегающих к пей диффузионных слоях.

Рис. 3.6. Клетка ацетабулярии

Изменения электрофизических свойств клеточных мембран, вызва нные ультразвуковым воздействием, весьма удобно исследовать, используя одноклеточн ый организм - ацетабулярию средиземноморскую.

Клетки ацетабулярии (рис. 3.6) длиной до 5 см и диаметром 0,3... .. ,0,5 мм покрыты прочной оболочкой, толщ ина которой достигает 30 мкм. Более 90 % объема клетки занимает вакуоль. Прото плазма, расположенная между вакуолью и оболочкой, имеет толщину 10...12 мкм.

Потенциал покоя ацетабулярии - максимальная разность электрических потенциалов между вакуолью в внешней средой - составляет 170 мВ, Потенциал покоя обусловлен функционированием насо са Cl-ионов с равновесным калиевым потенциалом, составляющим 90 мВ. Внешние раздражители приводят к изменен ию потенциала покоя. Разность потенциалов ус танавливается при этом на уровне 80 мВ и не меняется в течение действия внешнею фактора.

Однако ацетабулярии, как и многие другие клетки, способна к ино му типу реакции на внешнее воздействие - генерации волны электрического возбуждения (потенциала действия). Отличительной особенностью потенциалов действия ацетабулярии является их большая длительность, д остигающая нескольких минут, что существенно облегчает изучение процесса возбу ждения. Амплитуда потенциала действия в среднем равна 110 мВ.

Специальная приставка к микроскопу (рис. 3.7) позволяет контрол ировать введение микроэлектродов и наблю дать за явлениями в клетке в процессе ультразвукового облучения.

Рис. 3,7. Приставка к микроскопу для изучения реакции изолированной клетки на ультразвуковое

воздействие:

1 - акустический преобразователь; 2 - поглотитель ультразвука; 3 - кольцевая осветительная арматура; 4 - спетонепроницаемый кожух; 5 - лампочки накаливания; 6 термостатирующая рубаш ка; 7 корпус из светонепроницаемого материала; 8 - полость, заполненная жидкостью, рассеивающей свет; 9 - покровное стекло; 10 - исследуемый объект; 11 – объектив микроскопа; 12 – микроэлектрод

Наиболее характерная реакция клеток на ультразвуковое воздействие (0.2...5 Вт/см2; 0,9 МГц; 5...30 с) - возникнов ение вызванного потенциала действия. Е го появление носит пороговой характер, зависит от интенсивности и длительности ультразвукового облучения (рис. 3.8), а величина на 5 ...20мВ превышает спонтанный потенциал действия. Типичная кривая изменения мембр анного потенциала ацетабулярии приведен а па рис. 3.9.

Потенциал действия не возникает, если первичная деполяризация н е достигает некоторой критической величины (1 5...33 мВ). Исходя из этого, можно объясн ить существование порогов ультразвуковых воздействий.

Рис. 3.9. Типичный потенциал действия ацетабулярии в ответ на ультразвук интенсивностью 0,5... 1 Вт/см2 и длительностью 1...5 мин (стрелка ми указаны моменты включения и выключени я ультразвука)

Вследствие деполяризаци и мембран под действием ультразвука пороговой интенсивности достигается критическая величина деполяризации, после чего гене рируется потенциал действия. При интенсивностях выше пороговых потенциал действи я возникает через 2…5 с после включения ультразвука. В области интенсивностей ультразвука, близких к пороговым (а также при малой индивидуальной чувствительности клетки), длительность латентного периода может достигать нескольких минут. Ультразвук подпороговых интенсивностей (0f2 Вт/см2) не вызывает возбуждения клеток.

Рис. 3,8. Пороговая кривая, характеризующая зависимость возникновения биоэлектрической реакции клеток ацетабулярии от интенсивности и длительности ультразвукового воздейст вия: о - отсутствие реакции; • - наличие реакции

Иногда наблюдается депо ляризация на 5... 10 мВ, которая исчезает в течение нескольких минут после выключения ультразвука. Этот факт, а также индивидуальные различия в величине порогов чувствительности к ультразвуковому воздействию свидетельствуют о существовании регулятор ных механизмов, способных до известной степени компенсировать изменения в клетке, обусловленные действием внешних факторов.

Визуальные наблюдения за клеткой но время ультразвукового воздействия позволяют обнаружить активизацию движения цитоплазмы. Этот эффект наблюдается и при воздействии другими раздражителями (локальные повышение или понижение температуры, введение микроэлектродов и т. д.) и, по-видимому, я вляется результатом неспецифкческсой реакц ии клетки на внешнее воздействие.

При относительно высок их интенсивностях ультразвука (0,6..1 Вт/ см2) наблюдается значительная деполяризация клеточных мембран. После выключения ультразвука потенциал через 2...5 мин устанавливается на уровне 90 мВ. Этот уровень регистрируется 25...40 мин, после чего по тенциал возвращается к исходным значениям (потенциал покоя), Пo-видимому, ультразвук овое воздействие с интенсивностью, превышающей 0,6 Вт/см2, не только нарушает дифф узионное равновесие на мембране, но и ингибирует активный транспорт ионов Сl-. После выключения ультразвука диффузионное равновесие восстанавливается в течение нескольких минут, и лишь значительно позже начинает функционировать активный транспорт.

Увеличение интенсивности ультразвука до 1 Вт/см2 (3...5 мин) вызывает структурные нарушения - разрывы и контрактуру цитоплазмы, появление пузырьков, перемешивание клеточного содержимого. Однако пи при этих, ни при более высок их интенсивностях ультразвука (до 2 Вт/см2 ) не отмечалось разрушения клеток. Высо кая механическая прочность ацетабулярии, очевидно, обусловлена большой (до 30 м км) толщиной ее клеточной стенки.

По-видимому наиболее известное явление, связанное с деполяризацией клеточных мембран, - это изменение их проницаемости. Закономерное увеличение проницаемости под действием ультразвука хорошо проявляется в клетках в суспензии - эритроцитах, лейкоцитах, клетках дрож жей и пр.

Исследования, проведенные на суспензии эритроцитов в физиолог ическом растворе, показали, что ультразвук существенно увеличивает скорость диффузии глюкозы и сахарозы в клетки из бога той сахарами среды.

Концентрация углеводов в среде, содержащей эритроциты, практи чески не меняется в течение 4 ч при 20 °С. Воздействие ультразвуком (0,1 Вт/см2; 0,9 М Гц; 20 мин) приводит к заметному уменьшению концентрации Сахаров и среде. После вы ключения ультразвука углеводы частично вывод ятся из эритроцитов (рис. 3.10).

Рис. ЗЛО, Влияние ультразвука (0,1 Вт/см2) на скорость поглощен ия эритроцитами глюкозы (1,2) и сахарозы (3,4) из раствора: 1/3 - контроль; 2, 4 - опыт (стрелками указаны моменты включения и выключения ультразвука)

Скорость выхода ионов калия из эритроцитов вдвое возрастает при увеличении интенсивности ультразвука от 0,2 до 0,6 Вт/см2 (0,9 МГц). Эффект при кратковременном воздействии (3...5 мин) о братим, так как работа Na+-K1 насоса, фу нкционирующего за счет энергии АTФ, восст анавливает исходную концентрацию ионов K+ в клетке после превращения ультразвуко вого воздействия. Если активность АТФ-азы подавить,например, уаба ином, то скорость выхода ионов К+ увеличится на 5... 10 %, а исходная концентрация в клетках после выключения ультразвука не восстанавливается. Длительное, в течение 30 мин, воздействие ультразвуком снижает активность Nа+-К+- АТФ-азы мембран эритро цитов в 2-8 раз, пропорционально увеличению интенсивности ультразвука от 0,2 до 0,6 Вт/см2.

Увеличение потока ионов K+ из клетки вовне в результате облегчения пассивной диффузии и уменьшения переноса этих ионов против градиента концентрации при подавлении ультразвуком активности Na+-K+-ATO-aзы приводит к существенному изменению состава внутриклеточной среды.

Скорость переноса через биологические мембраны относительно крупных молекул практически не изменяется под действием ультразвука. Так, проницаемость мембран эритроцитов цыплят по отношению к меченому лейцину не испыты вает достоверных изменений после 30-мину тн от воздействия ультразвуком со средн ей интенсивностью 0,6 Вт/см2 и частотой 1 МГц, а скорость накопления меченого тимидица в этих же условиях (in vitro) даже несколько уменьшается.

Отсутствие эффекта увеличения под действием ультразвука прони цаемости клеточных мембран по отношению к лейцину и тимидину вызывает у некоторых исследователей скептическое отношение к возможности увеличить проницаемость мембран и для других веществ. Тем не менее ультразвук (0,1...2 Вт/см2; 0,88 МГц; 5...60 м ин) существенно увеличивает чувствительность бактериальных клеток к антибиотикам, широко используется в клинике для введения лекарств в организм сквозь неповрежденную кожу (фонофорез), в гистохими и для импрегнации нервных тканей серебром и т, д.

Изменения в свойствах к леточных мембран, подвергнутых ультразвуковому воздействию, могут быть вызваны переменными усилиями, возникающими в жи дкости при распространении ультразвуковой волны. Частицы жидкости в ультразвуковом поле колеблются относительн о состояния равновесия с частотой ультраз вука. У поверхности благодаря силам сцепления частицы практически неподвижны, однако амплитуда скорости смещения быст ро увеличивается по мере удаления от поверхности. Компонента скорости, касательной к п оверхности на расстоянии Z от этой поверхности

•- амплитуда скорости в объеме жидкости вдали от поверхности;

•- круговая частота;

•- плотность жидкости;

- вязкость жидкости.

Скорость достигает при где имеет размерность длины и представляет собой толщину слоя, где скорость меняется от 0 до , Эта величина называется толщиной акустического поверхностного слоя.

При интенсивности ультр азвука 0,1 Вт/см2 и частоте 1 МГц толщина этого слоя около 0,56 мкм, а градиент скорости при , Переменное

напряжение сдвига, обус ловленное градиентом , и составляет 100 H/м2 (0,1 Вт/см2; 1 МГц). Это значение по абсолютной величине превосходит уровень, при котором разрушаются мембраны эритроцитов (60 Н/м2),

Изменяясь с удвоенной частотой ультразвука, переменные напряж ния сдвига «не успевают» обусловить механических повреждений в клеточной ме мбране, изменяют, однако, состояние ее пов ерхности: нарушают двойной электрический слой, смещают глобулы белков, располо женные на поверхности мембран, снижают диффузионные ограничения и т.д. В результате изменяются мембранный потенциал ( потенциал) и

проницаемость мембран, возможны также конформационные переходы в мембранных белках, ведущие к изменению их ферментативной активности.

Таким образом, переменные высокочастотные возмущения вблизи мембран могут «детектироваться» клеточной мембраной, обусловливая изменения в свойствах клеток, заметные в течение весьма длительного времени (до десятков минут) после прекращения ультразвукового воздействия.

Скорость оседания эритроцитов, например, увеличивается в результате воздействия ультразвуком с интенсивностью 8 мВт/см2 (1 МГц), что, вероятно, свидетельствует об уменьшении их поверхностного заряда.

Мембранный потенциал эритроцитов крысы заметно уменьшается под действием ультразвука и возвращается к исходным значениям через 15...30 мин после прекращения облучения.

Уменьшается на 5...10 % электрофоретическая подвижность клеток асцитной карциномы Эрлиха, подвергнутых действию ультразвука (0,5.,3,2 МГц; 10 Вт/см2 SPTA). Понижается электрофоретическая подвижность и лимфомы мышей (2 МГц; 10 Вт/см2 SPTA). Эффект обнаруживается только при кавитации и заметно уменьшается с повышением статического давления или при укорочении длительности акустического импульса, т. е. при условиях, когда возникновение кавитирующих пузырьков затруднено.

Часть клеток при облучении ультразвуком разрушается, но клетки, пережившие воздействие, по внешнему виду и способности к пролиферации не отличаются от контрольных, хотя их электрофоретическая подвижность возвращается к нормальным значениям лишь через 45...50 ч,

З.З.1 Действие ультразвука на внутриклеточные структуры

Реакция клетки на ультразвук не ограничивается изменениями только в ее поверхностных структурах, В клетках, помещенных в ультразвуковое поле, возникают энергичные микропотоки, перемешивающие ее содержимое, меняющие взаиморасположение клеточных органелл. Источниками таких микропотоков может оказаться пульсирующий газовый пузырек, если расстояние между ним и клеткой не превышает 5 • 10-2 см.

По всей вероятности, ультразвук оказывает влияние не только на жизнедеятельность клетки в целом, но и на структуру и функции отдельных клеточных органелл.

Под влиянием ультразвука (0,2 Вт/см2; 0,88 МГц) меняются условия транспорта ионов через мембрану митохондрий, наблюдается разобщение свободного дыхания и фосфорилирующего окисления в них. Степень разобщения возрастает при увеличении интенсивности ультразвука от 0,05 до 1,2 Вт/см2, достигая максимума при 1 Вт/см2 (0,88 МГц; 5 мин). При 2,5 Вт/см2 (1 МГц; 5 мин) возникают нарушения в мембранах лизосом, что можно наблюдать на типичной картине лизиса клеток печени крыс. Аналогичный эффект наблюдается и под действием низкочастотного (20 кГц) ультразвука.

В определенных условиях ультразвук (2 Вт/см2; 0,75 МГц) может вызвать разрушение ядер в клетках Не La, не нарушая при этом целостности цитоплазматических мембран. Такие специфические нарушения не могут быть обусловлены кавитацией и микропотоками и предположительно объясняются возникновением резонансных волн на поверхности ядерных мембран. Кроме того, ультразвук (0.5...3 Вт/см2; 0,8...2 МГц; 2... 10

мин) вызывает изменение числа гранул гликогена в клетках, нарушение целостности эндоплазматического ретикулума, увеличение количества лизосом, изменение структуры митохондрий в клетках и т. д.

Несмотря на кажущуюся простоту ситуации, в настоящее время оказывается весьма непросто выделить первичные явления в клетке, вызванные физико-химическими процессами в ультразвуковом поле.

Действительно, количество гликогена в клетке, число и активность лизосом, форма саркоплазматической сети меняются в широких пределах в процессе жизнедеятельности. Поэтому наблюдаемые под действием ультразвука изменения могут свидетельствовать только о биологической реакции клетки на внешнее неспецифическое воздействие. Если ультразвуковое воздействие оказалось не летальным для клетки, то возникшие в ней изменения репарируются в течение примерно 100 ч. Лишь митохондриям необходимо значительно больше времени для восстановления своей структуры и функции.

3.3.2. Последействия ультразвука

на жизнедеятельность клетки

Наблюдая за клеткой после облучения ультразвуком, можно обнаружить, что в течение достаточно длительного времени в клетке развиваются процессы последействия, приводящие к морфологическим и функциональным изменениям.

Некоторые из наблюдаемых процессов, например увеличение проницаемости и уменьшение мембранного потенциала под действием ультразвука и последующее возвращение этих параметров к исходным значениям, но крайней мере, частично, обусловлены достаточно простыми физико-химическими явлениями.

Так, состояние поверхности клетки, нарушенное ультразвуковыми микропотоками, способными «смыть» поверхностно-активные биомакромолекулы, самопроизвольно восстановится, по меньшей мере, через несколько минут.

Длительно в реальном масштабе времени и восстановление доннановского равновесия, обусловленного разделением ионов на мембране и нарушаемого микропотоками, увеличивающими градиенты концентрации.

Оба процесса - адсорбция поверхностно-активных веществ на клеточной мембране и восстановление равновесия Допнана контролируются диффузией и достаточно медленны.

Сравнивая время восстановления биологических функций клеточных мембран со временем, характерным для формирования поверхностей раздела в растворах, содержащих высокомолекулярные поверхностно-активные вещества, можно видеть, что эти величины совпадают в пределах порядка.

Так, электрофоретическая подвижность эритроцитов, сниженная в результате ультразвуковой обработки (0,02... 1 Вт/см2; 0,4 МГц и 0,8 МГц; 3 с.,.3 мин), восстанавливается через 3...5 мин после выключения ультразвука. В течение 15...30 мин остается повышенной проницаемость мембран эритроцитов и лимфоцитов для молекул красителя трипанового синего.

В связи с этим необходимо отметить, что общепринятый метод определения жизнеспособных и мертвых клеток по окрашиваемости последних трипановым сипим или другими красителями не всегда пригоден для клеток, подвергнутых ультразвуковому воздействию. Сразу после ультразвукового облучения клетки могут легко окрашиваться из-за повышенной проницаемости мембран, по через 20...50 мин окрашиваемых клеток оказывается примерно столько же, сколько и в контрольном образце, не облученном ультразвуком.

Другие процессы, развивающиеся в клетке после ультразвукового воздействия, имеют выраженный характер биологического ответа на внешнее возмущение.

Клетки тромбоцитов, например, подвергнутые ультразвуковой обработке (1 МГц; 0,2.„0,6 Вт/см2; 5 мин), на электронных микрофотографиях не отличаются от контрольных К функционируют как интактные. Однако через 30 мин инкубации при 22 °С в контрольных и облученных ультразвуком клетках возникают заметные функциональные и морфологические различия. Время рекальцификации тромбоцитов, мало изменяющееся в процессе ультразвуковой обработки (1 МГц; 0,065...2 Вт/см2, 5 мин), необратимо снижается в течение 4...6 ч после облучения.

Обратимое снижение электрокинетического потенциала клеток лимфомы мышей можно наблюдать в течение 40...48 ч после ультразвукового воздействия (2 МГц; 10 Вт/см2SPTA\ 5 мин).

Ультразвуковое воздействие на метки в суспензии или в культуре в зависимости от параметров ультразвука и условий облучения может обусловить как стимуляцию, так и подавление процессов их жизнедеятельности.

В относительно мягких условиях ультразвуковой обработки (1...5 МГц; 0,2...1 Вт/см2; 5 мин; импульсный режим) наблюдаются процессы стимулирования синтеза соединительного белка в клетках культуры фибробластов, интерферона в лейкоцитах и т.д. Увеличение интенсивности ультразвука приводит к угнетению биохимических про- цессов в клетках, к уменьшению числа клеток в культуре, причем наиболее выраженное угнетение наблюдается на частоте 1 МГц.

При невысоких (терапевтических) интенсивностях ультразвука эффект стимулирования синтеза белка наблюдается и в тканях теплокровных.

Так, 3-4 сеанса облучения ультразвуком (3 МГц; 0,5 Вт/см2; 5 мин) вызывают в тканях уха кролика, поврежденного криохирургическим инструментом, заметное ускорение синтеза коллагена. Этот эффект лежит в основе ультразвуковых методов ускорения заживления ран.

Ускорение биохимических процессов в клетке приводит к повышению ее физиологической активности, к увеличению сопротивляемости внешним воздействиям.

Клетки костного мозга, облученные ультразвуком (0,8 МГц; 0,3...0,7 Вт/см2; 20 мин) и введенные контрольным животным, дают начало большему числу колоний на поверхности и в паренхиме селезенки. Колонии растут быстрее, ускоряется и дифференциация колоний.