§ 2. Clostridium perfringens.

(Синонимы - C. welchii, Bacillus aerogenes capsulatus, B. phlegmonis emphysematosae).

Эти клостридии впервые были культивированы Акальмом (1891 г.), но детально описаны В. Велшем и Г. Нуталом (1892 г.), которые изолировали их из крови и органов трупа человека. Они являются наиболее важным этиологическим фактором газовой гангрены, также вызывают пищевое оваренние и некротический энтерит у человека и много серьезных заболеваний животных. C. perfringens являются составной частью нормальной микрофлоры толстой кишки, их выделяют из фекалий, они обитает на коже промежности, ягодиц и бедер. Споры находят в почве, пыли и воздухе.

Морфология. Это грамположительные бактерии с прямыми параллельными сторонами и округлыми или обрезанными концами, центрально или субтерминально расположенными спорами; имеют размер 4-6_*1 мкм, в мазках располагаются одиночно, цепями или небольшими скоплениями. Они полиморфны, часто возникают ниточные и инволюционные формы; образуют капсулы, неподвижны. При культивировании на питательных средах материала, полученного от больных газовой гангреной, спор не образуют, это является одной из характерных особенностей C. perfringens.

Культивирование. Эти бактерии являются анаэробами, но могут расти в микроаэрофильных условиях. Кислород не влияет токсично на клостридии газовой гангрены, при культивировании в аэробных условиях они не гибнут, как это происходит с требовательными анаэробами. Они растут при рН 5,8-8,0 и температуре 20-50ºС. Они, как правило, хорошо растут при 37ºС, но оптимальной температурой для большинства штаммов является 45ºС, при этой температуре время деления может составлять всего 10 минут. Это свойство используют для получения чистых культур C. perfringens. В мясной бульон Робертсона вносят смесь C. perfringens с другими бактериями и инкубируют при 45ºC в течение 4-6 часов, что служит средой обогащения. Перенос этих культур на кровяной агар приводит к чистому или преобладающему росту C. perfringens. Хороший рост наблюдается на среде Робертсона, мясо приобретает розовый цвет, но не переваривается, культура имеет кислую реакцию и кислый запах. При культивировании в лакмусовом молоке происходит ферментация лактозы с образованием кислоты, о чем свидетельствует изменение цвета лакмуса с голубого на красный. Кислота коагулирует казеин (кислотные сгустки) и свернутое молоко разрушается вследствие интенсивной продукции газа. Вследствие этого парафиновая корка выталкивается и сгустки молока покрывают стенки пробирки. Это явление называют “бурным брожением”. После 12-часовой инкубации на агаре с сывороткой крови человека, кролика или барана колонии большинства штаммов вызывают “направленный гемолиз”, выражающийся в наличии узкой зоны полного гемолиза вследствие влияния тета-токсина и значительно более широкой зоны неполного гемолиза под влиянием альфа-токсина. Это явление гемолиза двух видов становится менее выраженным при продолжительной инкубации.

Ферментативные свойства. Клостридии ферментируют с образованием кислоты и газа глюкозу, мальтозу, лактозу и сахарозу. Тесты на образование индола и Фогеса-Проскауэра - отрицательные, тест с метиленовым красным - положительный. Продуцируют большое количество сероводорода. Большинство штаммов расщепляет нитраты.

Токсинообразование. C. perfringens являются наиболее токсинопродуцирующими микробами, способными секретировать минимум 12 различных токсинов, а также других ферментов и биологически активных растворимых веществ. Четыре “основных токсина”, альфа-, бета-, эпсилон- и иота-, предопределяют патогенность. Альфа-токсин продуцируют все типы C. perfringens, но больше всего - штаммы типа А. Этот токсин имеет наибольшую биологическую значимость и вызывает токсемию при газовой гангрене; он летальный, дерматонекротический и гемолитический. По химическому составу это фосфолипидаза (лецитиназа С), которая в присутствия ионов кальция и магния расщепляет лецитин до фосфорилхолина и диглицерида. Эта реакция имеет проявление в виде переливчатости в сывороточной или желтковой среде и специфически нейтрализуется антитоксином. Когда C. perfringens выращивают на среде, содержащей 6 % агар, 5 % пептически переваренной крови барана и 20 % сыворотку крови человека, и на половину чашки наносят антитоксин, колонии на половине без антитоксина окружает непрозрачная зона. Благодаря специфической нейтрализации альфа-токсина на половине с антитоксином непрозрачных участков вокруг колоний не будет. Это явление получило название реакции Наглера и используется для экстренной индикации C. perfringens в клиническом материале. Добавление неомицина сульфата к среде делает её более селективной, угнетая рост аналогичных бактерий и спорообразующих аэробов. Сыворотку крови человека можно заменить на 5 % яичный желток. Помутнение среды с яичным желтком может быть вызвано другими бактериями с лецитиназной активностью (C. novyi, C. bifermentans, некоторые вибрионы, спорообразующие аэробы). При наличии этих бактерий реакция не нейтрализуется антитоксином против C. perfringens, исключение составляют C. bifermentans, которые продуцируют серологически подобную лецитиназу.

Альфа-токсин гемолизирует эритроциты большинства животных (кроме лошадей и коз) и человека благодаря влиянию на фосфолипиды клеточных мембран. Лизис происходит при разных температурах, но наиболее четко наблюдается после инкубации при 37ºC с последующим охлаждением до 4ºC. Токсин является относительно термостабильным и только частично инактивируется кипячением в течение 5 минут. Бета-, эпсилон- и иота-токсины имеют летальные и некротические свойства; гама- и эта-токсины менее летальны; дельта-токсин имеет летальное действие и вызывает гемолиз эритроцитов парнокопытных животных (овец, коз, свиней, крупного рогатого скота). Тета-токсин являются кислородлабильным гемолизином, имеющим антигенное сходство со стрептолизином О; он вызывает гибель и цитолиз. Каппа-токсин являются коллагеназой, ламбда-токсин - протеазой и желатиназой, мю-токсин - гиалуронидазой, ню-токсин – ДНКазой.

Кроме токсинов, C. perfringens также продуцируют другие растворимые вещества, некоторые из которых имеют ферментативные свойства. К этим веществам относят: (1) ферменты, которые разрушают компоненты крови; (2) нейраминидазу, разрушающую рецепторы к миксовирусам на эритроцитах; (3) вещество, которое делает эритроциты панагглютинабельными путём экспозиции их Т-антигенов; (4) гемагглютинин, активный в отношении эритроцитов человека и большинства животных; (5) фибринолизин; (6) гемолизин, отличный от альфа-, тета- и дельта-токсинов; (7) гистамин; (8) “фактор взрыва”, специфически действующий на мышечную ткань и предопределяющий специфичность поражений мышц при газовой гангрене; (9) “циркулирующий фактор”, вызывающий повышение чувствительности к адреналину капиллярного русла и угнетающий фагоцитоз.

Антигенная структура. Антигенные структурные компоненты, связанные с вирулентностью, идентификацией, классификацией и диагностикой, неизвестны.

Классификация. Штаммы C. perfringens разделяют на 5 типов (от А до Е) на основании токсинов, которые они продуцируют. Поскольку клостридии продуцируют большое количество токсинов, типирование зависит от 4 “основных токсинов”. Типирование проводят в реакциях нейтрализации со специфическими антитоксинами путем подкожного введения морским свинкам или внутривенных инъекций мышам.

Резистентность. Споры обычно разрушаются при кипячении в течение 5 минут, но споры штаммов типа А и некоторых штаммов типа С, ответственных за развитие пищевых отравлений, выдерживают кипячение в течение 1-3 часов. Автоклавирование при 121ºC в течение 15 минут разрушает споры. Споры устойчивы к действию антисептиков и общепринятых дезинфектантов.

Патогенность для животных. Среди лабораторных животных чувствительными к инфицированию являются морские свинки, кролики, голуби и мыши. При вскрытии животных выявляют отек и некроз тканей с накоплением газа в очаге пенетрации возбудителя. Наиболее часто клостридии выявляют в крови.

Патогенез и заболевания человека. C. perfringens вызывают следующие заболевания человека. Некоторые штаммы типа А могут вызывать пищевые отравления. Они характеризуются резистентностю своих спор к нагреванию и слабой продукции альфа- и тета-токсинов. Они продуцируют термолабильный энтеротоксин, который, подобно энтеротоксину холерного вибриона и энтеротоксигенным кишечным палочкам, ведет к накоплению жидкости в подвздошной кишке кролика. Пищевые отравления C. perfringens обычно вызывает употребление в пищу мяса. После инкубационного периода в течение 8-24 часов возникает боль в животе, понос и рвота. Болезнь является самоограниченной и выздоровление наступает в течение 24-48 часов. Диагноз подтверждают путем изоляции C. perfringens типа А из испражнений и пищи. Поскольку эти клостридии являются составными компонентами нормальной микрофлоры кишок, изоляция их из испражнений (кроме больших количеств) не имеет диагностического значения. Изоляцию из пищевых продуктов следует проводить путем прямого посева на селективные среды, поскольку клостридии присутствуют в пище преимущественно в виде вегетативных клеток.

Штаммы C. perfringens типа А (и иногда типа D) были изолированы при гангренозном аппендиците. Этиологическая роль клостридий в этом случае была подтверждена положительным влиянием антитоксина на течение болезни у этих пациентов. Считают, что токсемия и шок в некоторых случаях кишечной непроходимости и перитонита могут быть вызваны влиянием токсинов C. perfringens.

Острый и часто фатальный некротический еюнит (некротический энтерит) вызывают штаммы типа С. Это заболевание возникает редко, но спорадические случаи и вспышки имели место в разных странах - Германии, Новой Гвинее, Восточной Африке, Таиланде и Непале. Активная иммунизация анатоксином, изготовленным из C. perfringens типа С оказалась эффективной в профилактике этого заболевания.

Некротический колит является редким, но фатальным заболеванием, при котором большие сегменты толстой кишки становятся гангренозными. Этиологическая роль C. perfringens при этом заболевании не доказана.

C. perfringens вызывает 2 серьезных заболевания желчевыводящего тракта - острый эмфизематозный холецистит и септицемию после холецистэктомии.

Газовая гангрена брюшной стенки является частым осложнением операций на органах брюшной полости. Инфекция является эндогенной, клостридии поступают из середины кишок во время оперативного вмешательства.

C. perfringens крайне редко вызывают абсцесс головного мозга и менингит. При проникающих травмах глаза может развиться панофтальмия. Клостридиальные инфекции грудной полости могут возникать как осложнения проникающих повреждений этой области; это часто имеет место во время боевых действий. Инфекции мочевыделительного тракта могут возникать как осложнения оперативных вмешательств, таких, как нефрэктомия. Клостридиальные инфекции матки могут возникать после септических абортов, которые часто сопровождаются септицемией.

C. perfringens типа А являются основным этиологическим фактором газовой гангрены. Они могут выступать в качестве единственного этиологического агента, но чаще они ассоциируются с другими клостридиями, а также неклостридиальными анаэробами и даже аэробами. Не все клостридиальные раневые инфекции приводят к развитию газовой гангрены, более часто они вызывают “раневую контаминацию” или анаэробный целюллит. Газовая гангрена возникает только при поражении мышечной ткани (анаэробный миозит).

Оукли (1954) определил газовую гангрену как миозит с явлениями отека, который быстро распространяется и возникает при тяжёлых ранениях большого количества мышечной массы, контаминированной патогенными клостридиями, особенно C. perfringens. В прошлом заболевания называли “злокачественным отеком”. Газовая гангрена была описана ещё Гиппократом (460-355 гг. до н.э.), но заболевание не имело существенного значения до Первой мировой войны. Газовая гангрена является типичным заболеванием войн, при которых часто возникают тяжёлые ранения с микробным загрязнением. В мирное время заболевание возникает после автомобильных катастроф или других травм, при которых происходит разрушение больших объемов мышечной ткани. Очень редко она возникает как осложнение хирургических вмешательств.

Бактериологический спектр газовой гангрены очень разнообразен. Редко она возникает вследствие инфицирования только клостридиями; чаще этиологическими агентами являются несколько видов клостридий в ассоциации с анаэробными стрептококками и факультативными анаэробами (кишечной палочкой, протеями и стафилококками). Среди патогенных клостридий наиболее часто идентифицируют C. perfringens (60 %), менее часто C. novyi и C. septicum (20-40 %), редко - C. histolyticum. Другими клостридиями, которые идентифицируют при газовой гангрене, являются C. sporogenes, C. fallax, C. bifermentans, C. sordellii, C. aerofoetidum и C. tertium; сами по себе они могут быть непатогенными, их выявление может быть обусловлено распространением видов в разных грунтах.

Клостридии попадают в раны, как правило, с чужеродными частицами, такими, как почва (особенно культивированная), дорожная пыль, кусочки тканей или шрапнель. Они также могут присутствовать на здоровой коже, особенно промежности и бедер. Иногда инфекция является эндогенной. Газовая гангрена иногда возникает после “чистых” хирургических процедур (особенно ампутаций при болезнях сосудов) и даже инъекций (особенно адреналина).

Простое присутствие клостридий в ране не означает наличия газовой гангрены. МакЛенан выделил 3 типа анаэробных раневых инфекций: (1) простая раневая контаминация без инвазии подлежащих тканей, при которой заживление ран задерживается; (2) анаэробный целюллит, при котором клостридии проникают в фасциальные участки без поражения мышц; заболевание имеет разную выраженность - от ограниченного “газового абсцесса” до тотального поражения конечности; анаэробный целюллит в 2-3 разы чаще, чем газовая гангрена, встречается во время военных действий; (3) анаэробный миозит, или газовая гангрена, связанный с инвазией клостридий в здоровую мышечную ткань и интенсивной продукцией экзотоксинов. Газовая гангрена возникает только в благоприятных условиях для размножения клостридий, наиболее важным являются низкое давление кислорода (наиболее часто это наблюдается при боевых ранениях).

Клостридии размножаются и вырабатывают токсины, которые вызывают дальнейшее поражение тканей. Лецитиназы повреждают клеточные мембраны и повышают проницаемость капилляров, приводя к экстравазации и повышению давления в пораженных мышцах, вызывая дальнейшее бескислородное поражение. Гемолитическая анемия и гемоглобинурия возникают вследствие лизиса эритроцитов альфа-токсином. Коллагеназы разрушают коллагеновые барьеры в тканях, гиалуронидазы расщепляют межклеточное вещество, способствуя инвазии клостридий. Интенсивная продукция газов уменьшает кровоснабжение путем давления, увеличивая бескислородный участок. Благодаря этому возбудители распространяются из локального очага, а заболевание прогрессирует. Инкубационный период может составлять от 7 часов до 6 недель после ранения, в среднем - 10-48 часов для инфекции, вызванной C. perfringens, 2-3 часа для C. septicum и 5-6 дней при инфицировании C. novyi. Заболевание характеризуется нарастающей болью, отеком и напряжением пораженного участка с признаками системной токсемии. Из раны выделяется водянистое содержимое в небольшом количестве, которое позднее становится профузным и серозно-кровянистым. Накопление газов вызывает крепитацию тканей. При отсутствии лечения заболевание быстро прогрессирует, развиваются токсемия и прострация, человек гибнет вследствие недостаточности кровообращения.

Иммунитет к реинфекции не формируется.

Лабораторная диагностика газовой гангрены. Диагноз газовой гангрены следует ставить по клиническим признакам, а функцией лаборатории являются только подтверждение клинического диагноза, идентификация и подсчет патогенов. Бактериологическое исследование помогает дифференцировать газовую гангрену от анаэробного стрептококкового миозита, который практически схож с гангреной на ранних этапах. При стрептококковом миозите при окраске по Граму в мазках выявляют большое количество стрептококков и гноя, а не клостридии, а при газовой гангрене - небольшое количество гноя и разнообразную бактериальную флору. Материалом для исследования являются: (1) мазки с мышц на границе пораженных участков, с тканей в зоне некроза и из экссудата подлежащих участков раны; (2) экссудат из участков с наиболее выраженным инфекционным процессом, а также из глубоких участков ран, который следует собирать с помощью пипетки или тампона; и (3) некротизированные ткани и фрагменты мышц. Окрашенные по Граму мазки позволяют определить виды клостридий и их количество; присутствие большого количества грампозитивных клостридий правильной формы без спор позволяет подтвердить наличие инфицирования C. perfringens. “Цитроновые тела” или плеоморфные клостридии, которые имеют вид лодок или листьев, означают наличие C. septicum; большие бактерии с овальными субтерминальными спорами - C. novyi; тонкие клостридии с круглыми терминальными спорами - C. tetani и C. tetanomorphum. Посевы на агар со свежей лошадиной кровью или подогретый кровяной агар культивируют в аэробных и анаэробных условиях; для предупреждения брожения рекомендуется использовать 5-6 % агар в чашках Петри. Для диагностики используют реакцию Наглера (см. пункт “Токсинообразование” § 1). Для дифференцирования клостридий с различными типами спор используют 4 пробирки с мясным бульоном Робертсона, в которые инокулируют микробы и нагревают до 100ºС в течение 5, 10, 15 и 20 минут с последующим субкультивированием на кровяном агаре через 24-48 часов. Кровяные культуры часто положительны, особенно C. perfringens, однако следует помнить, что бактериемия, вызванная C. perfringens, может возникать без газовой гангрены, а изоляты идентифицируют по их морфологическим, культуральным, биохимическим и токсигенным свойствам.

Лечение газовой гангрены. При газовой гангрене наиболее важным профилактическим и лечебным мероприятием является хирургическое вмешательство. Все поврежденные ткани следует немедленно удалять и очищать раны от кровяных сгустков, некротизированных тканей и чужеродных частиц. При установленном диагнозе газовой гангрены полное и немедленное удаление всех пораженных тканей может спасти жизнь. По возможности следует использовать гипербарическую оксигенацию.

Профилактика газовой гангрены. Эффективным является использование антибиотиков в комбинации с хирургическими манипуляциями. Препаратом выбора является метронидазол, который вводят внутривенно перед хирургической обработкой и повторяют инъекции каждые 8 часов в течение 1 суток. Поскольку часто возникают смешанные аэробные и анаэробные инфекции, следует использовать комбинацию метронидазола, гентамицина и амоксициллина. Пассивную иммунизацию осуществляют противогангренозной сывороткой (лошадиным поливалентным антитоксином в дозе 10 тысяч МЕ C. perfringens, 10 тысяч МЕ C. novyi и 5 тысяч МЕ C. septicum), которую вводят внутримышечно или в экстренных случаях - внутривенно; но в связи с сомнительной эффективностью антитоксина и недоступностью его применяют редко. Активная иммунизация анатоксинами вызывает развитие выраженного антитоксического иммунного ответа в эксперименте, но в клинических условиях не используется.