2.1. Определение прочности связи между белковым и липидным компонентами липопротеидов ткани печени по качественной пробе л. Делямуре

2.2. Сделать выводы и оформить отчет.

3. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Липопротеиды - это сложные комплексные соединения, в состав которых, кроме белка, входит липидный компонент. Липидами называются органические вещества, существенно различающиеся по химической природе и выполняемым функциям, но обладающие сходными признаками, а именно нерастворимостью в воде и растворимостью в неполярных растворителях, таких как хлороформ, эфир или бензол.

Липид-белковые комплексы условно делятся на липопротеиды, растворимые в воде, и структурные протеолипиды, являющиеся жирорастворимыми. Биологическая роль этих комплексов огромна. Липофильные протеолипиды являются основой биологических мембран и определяют их свойства и функции, а следовательно, отвечают за селективные и защитные механизмы, проведение нервного импульса; входя в состав переносчиков дыхательной цепи, активизируют процессы переноса электронов и протонов и т.д.. Гидрофильные липопротеиды выполняют в основном транспортную функцию и участвуют в переносе гидрофобных липидов, жирорастворимых витаминов и гормонов к различным органам и тканям.

4. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

4.1. Определение прочности связи между белковым и липидным компонентами липопротеидов ткани печени по качественной пробе л. Делямуре

Прочность связи между белками и липидами в липопротеидных комплексах исследуют методом экстракции липидов серным эфиром с последующей окраской их суданом III.

Ход работы

4.1.1. Экстрагирование липопротеидов из ткани. 1 г печени растирают в ступке, прибавляют 5 мл физиологического раствора, снова тщательно растирают и оставляют стоять 30 мин, периодически перемешивая пробу.

Жидкость с осадка сливают в колбочку, а остаток ткани снова растирают с 5 мл физиологического раствора. Жидкость сливают в ту же колбу, раствор фильтруют или центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают в мерный цилиндр и физиологическим раствором доводят объем до 50 мл.

4.1.2. Экстрагирование липидов серным эфиром из липопротеидного комплекса.

В контрольную пробирку отмеривают 0,9 мл надосадочной жидкости из цилиндра (или сыворотки крови) и 0,1 мл физиологического раствора.

В опытную пробу - 0,9 мл надосадочной жидкости из цилиндра (или сыворотки крови) и 0,1 мл 0,05% раствора тиолового яда (йодацетата).

В обе пробирки приливают по 2-3 капли спиртового раствора судана-III. Пробирки встряхивают, затем добавляют по 1 мл серного эфира, снова встряхивают и оставляют стоять до расслоения жидкостей. В контрольной пробе липопротеидный комплекс не разрушается, поэтому судан-III окрашивает нижний водный слой. В опытной пробе тиоловый яд разрушает связь между белковым и липидным компонентами липопротеида, серный эфир экстрагирует липидный компонент, поэтому судан-III окрашивает верхний эфирный слой.

Результаты работы заносят в таблицу 9:

Результаты опыта Таблица 9.

Проба	Количество надосадочной жидкости, мл	Тиоловый яд, мл	Физиологический раствор, мл	Серный эфир, мл	Результат
1	0,9	-	0,1	1,0
2	0,9	0,1	-	1,0

5. СОСТАВЛЕНИЕ ОТЧЕТА

Отчет составляется с указанием цели, задания, экспериментальные данные и выводы.

6. ВОПРОСЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ

6.1. Что такое липопротеиды и из каких компонентов они состоят?

6.2. Как можно подразделить липид-белковые комплексы? Какова их биологическая роль?

6.3. Какими белками представлен белковый компонент в сывороточных липопротеидах?

6.4. Каков состав простетических групп липопротеидов?

6.5. Как связаны белковый компонент и простетическая группа в липопротеидах?

6.6. В чем сходство и различия - и -липопротеидов, хиломикронов и пре--липопротеидов?

6.7. Какие классы сывороточных липопротеинов рассматриваются как атерогенные и антиатерогенные факторы?

6.8. В чем заключается метод определения прочности связи между белковым и липидным компонентами липопротеидов по качественной пробе Л.Делямуре?

6.9. На чем основан метод электрофоретического разделения сывороточных липопротеидов?

6.10. Каково клиническое значение определения - и -липопротеидов в сыворотке крови?

6.11. При каких патологических состояниях увеличивается доля -липопротеидов?

6.12. Что такое гиперлипопротеинемия? Какие типы гиперлипопротеидемий Вам известны?

Тема: ФЕРМЕНТЫ

1. ЦЕЛЬ

Изучить свойства ферментов как биологических катализаторов.

2. ЗАДАЧИ

2.1. Изучить определение активности α-амилазы слюны и ее термолабильности.

2.2. Влияние реакции среды на активность ферментов и определение оптимума рН действия α-амилазы слюны.

2.3. Изучить влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы слюны.

2.4. Изучить специфичность α-амилазы слюны.

2.5. Сделать выводы и оформить отчет.

3. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Ферменты (энзимы) – это биологически активные вещества белковой природы, выполняющие в организме роль катализаторов и поддерживающие на определенном уровне скорость всех протекающих процессов.

По химической природе ферменты делятся на простые (протеины), имеющие в своем составе только полипептидные цепи и при гидролизе образующие аминокислоты, и сложные (протеиды или холоферменты), состоящие из белковой и небелковой частей, называемых апоферментом и кофактором соответственно. Кофакторы, в свою очередь, можно подразделить на легкодиссоциирующие, свободно присоединяющиеся к различным апоферментам (коферменты), и труднодиссоциирующую простетическую группу, взаимодействующую лишь с одним апоферментом. Так, например коферментом лактатдегидрогеназы является никотинамидадениндинуклеотид (НАД⁺), тогда как сукцинатдегидрогеназа имеет в своем составе прочносвязанную с апоферментом простетическую группу, представленную производным рибофлавина – флавинадениндинуклеотидом (ФАД). Кофактор определяет каталитическую специфичность фермента, выступает в роли косубстрата в ферментативной реакции и стабилизирует пространственную структуру апофермента, что играет важную роль в соединении фермента (E) с субстратом (S). В качестве кофакторов могут выступать ионы металлов (Mg²⁺, Mn²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Zn²⁺ и др.) или вещества органической природы (нуклеотиды, производные витаминов и др.). Апофермент, в свою очередь, определяет субстратную специфичность фермента, непосредственно участвует в связывании фермента с субстратом и облегчает действие кофермента на субстрат. Таким образом, белковая и небелковая части двухкомпонентных ферментных систем могут действовать только согласованно, и дефицит одного из двух названных выше компонентов фермента приводит к нарушению его эффективной работы.

Механизм действия ферментов объясняется теорией гомогенного катализа. Фермент вступает во взаимодействие с субстратом с образованием фермент-субстратного комплекса, который, в свою очередь, взаимодействует дальше. При этом фермент отделяется и затем вступает во взаимодействие с новым субстратом. Таким образом, фермент катализирует реакцию между двумя субстратами, а сам при этом не расходуется. Если же в состав фермента входит кофермент, то фермент катализирует реакцию не между двумя субстратами, а между субстратом и коферментом. Кофермент является связующим звеном между двумя ферментами. Особенностью многих ферментов является обратимость их действия, т.е. один и тот же фермент может катализировать как прямую, так и обратную реакцию.

В молекулах ферментов выделяют активный и аллостерический (регуляторный) центры.

В активный центр фермента входят остатки аминокислот (принадлежащие апоферменту), ионы металлов и коферменты. Эта часть ферментативной молекулы формируется при связывании субстрата и/или кофермента (для холоферментов), а для регуляторных ферментов образование активной конформации аминокислот активного центра возможно при взаимодействии молекулы вещества-активатора, отличного по структуре от субстрата, с аллостерическим центром фермента. В активном центре условно различают два участка: контактный, связывающий субстрат, и каталитический, осуществляющий его преобразование. Первый присоединяет специфический субстрат, образуя промежуточный фермент-субстратный комплекс (ES), второй вызывает его катализ с получением продуктов реакции (Р) и свободного фермента (Е):

E + S  [ES]  [EP]  E + P

В аллостерическом центре, который представляет собой любой участок фермента, не входящий в состав активного центра, присоединяются вещества, называемые эффекторами или модификаторами, в результате чего изменяется пространственная структура молекулы, в целом, и конфигурация активного центра, в частности. Это снижает или увеличивает ферментативную активность, поэтому модификаторы можно подразделить на ингибиторы и активаторы, соответственно.

Ферменты как биологические катализаторы обладают рядом общих свойств, важнейшими из которых являются высокая активность и специфичность действия. Все ферменты проводят катализ в очень мягких условиях и обладают очень высокой активностью. Ферменты обладают специфичностью, так как каждый из них катализирует лишь определенные химические реакции. Различают абсолютную и относительную специфичность действия. Ферменты, обладающие относительной специфичностью действия, катализирует реакции у близких по строению веществ, действуя на определенный тип связи. К ним относят ферменты желудочно-кишечного тракта: трипсин, пепсин и др. Ферменты, обладающие абсолютной специфичностью, действуют на один определенный субстрат. Так, мальтаза расщепляет мальтозу, не оказывая никакого действия на сахарозу.

Поскольку ферменты являются белками, на их активность влияют температура (они термолабильны), рН среды, наличие различных химических веществ и т.д. Следовательно, скорость ферментативного катализа зависит от многих факторов: температура, рН среды концентрации субстрата и фермента и т.д. Одним из важнейших факторов, от которого зависит активность фермента, является температура. С изменением температуры активность фермента изменяется.

Каждый фермент имеет свой температурный оптимум. У большинства ферментов он лежит в интервале 37-40^оС. Повышение температуры выше 70^оС приводит к потере активности фермента. Фермент необратимо инактивируется вследствие денатурации белка. Понижение температуры, как и повышение, приводит сначала к уменьшению, а потом и к полной активности фермента. Но при низких температурах ферменты не разрушаются, поэтому при последующем повышении температуры их активность восстанавливается (обратимая инактивация).

Активность ферментов меняется в зависимости от реакции среды. Для каждого фермента существуют оптимальные значения рН, при котором он проявляет максимальную активность. Так, для пепсина оптимальные значения рН=1.5-2.5, в то время как трипсин при таких условиях полностью теряет способность гидролизовать белки. Оптимум его действия наступает при рН=8-9.

На скорость ферментативного катализа влияет также присутствие определенных веществ, которые могут и увеличивать активность фермента (активаторы), и уменьшать ее (ингибиторы). Активаторы и ингибиторы влияют на активный центр фермента, способствуя его образованию (активаторы) или блокированию (ингибиторы). Одно и тоже вещество для одного фермента может быть активатором, а для другого – ингибитором.

Изучение влияния различных факторов на скорость ферментативного катализа проводят, используя ферменты слюны: амилазу и мальтазу. Действие ферментов выявляют либо по исчезновению субстрата, либо по появлению продуктов его расщепления. Амилаза катализирует гидролиз гликозидной связи крахмала и гликогена, расщепляя сначала их до декстринов, а затем до мальтозы. Крахмал с йодом дает синее окрашивание. Декстрины в зависимости от размера дают разное окрашивание – от фиолетового до красно-бурого. Мальтоза с йодом окрашивания не дает. Мальтаза расщепляет мальтозу до глюкозы, имеющей альдегидную группировку, по реакции на которую она может быть обнаружена.

Большинство ферментов, катализирующих химические реакции, протекающие в живом организме, функционируют внутри тех клеток, в которых синтезируются (за исключением ферментов органов пищеварения и отдельных энзимов плазмы крови). Тем не менее на основании результатов ферментативного анализа внеклеточных жидкостей (особенно плазмы или сыворотки крови) можно сделать заключение об изменениях, происходящих внутри клеток разных органов и тканей.

В основе многих болезней лежат нарушения нормального функционирования ферментативных процессов. Изменения в специфических ферментативных реакциях можно рассматривать как причину или следствие различных патологических состояний. Эта взаимосвязь наиболее отчетливо выявляется при некоторых врожденных нарушениях метаболизма, называемых энзимопатиями. Например, фенилкетонурия возникает вследствие дефекта фермента фенилаланин-4-монооксигеназы, галактоземия является результатом мутаций одного из трех генов, кодирующих ферменты метаболизма галактозы, дефицит лизосомальных ферментов приводит к развитию патологических состояний, известных под названием «болезней накопления» (тезауризмозов) – сфинголипидозов, мукополисахаридозов и др.

4. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ