Лекция 2

7

Физиология микроорганизмов

Большинство животных, включая человека, способны заглатывать и переваривать плотные частички пищи в основном за счет их гидролиза. Подобный тип питания называется голозойный. Бактерии не способны захватывать твердофазные объекты и утилизируют питательные вещества в виде относительно простых молекул в водных растворах. Такой тип питания называется голофитный, он присущ также всем растениям.

Тем не менее, многие бактерии способны утилизировать твердую пищу с помощью так называемого внешнего питания, которое реализуется вне клеток при помощи ферментов. Контакт пищеварительных ферментов с субстратом приводит к образованию простых водорастворимых молекул, которые проникают через клеточную стенку в цитоплазму.

К основным соединениям, которые усваивают бактерии, относят углеводы, аминокислоты, жирные кислоты, минеральные соли, витамины и др. Они могут утилизировать вещества, не пригодные для живых клеток, например карболовую кислоту, парафин, мыло и др. Подобно всем прочим формам жизни бактерии нуждаются в одних и тех же элементах – C, H, O, N, P, S, K, Ca, Mg, Fe; а также в микроэлементах – Mn, Mo, Zn, Cu, Co, Ni, Va, B, Cl, Na, Se, Si, Wo и др., которые не являются обязательными для всех организмов, но бактериям они необходимы для синтеза коферментов, либо для поддержания своего специфического метаболизма. Помимо источников углерода, энергии и элементов минерального питания, многие микроорганизмы нуждаются в некоторых дополнительных веществах, называемых факторами роста.

Метаболизм бактерий объединяет два процесса: катаболизм (диссимиляция, или энергетический метаболизм) и анаболизм (ассимиляция, или пластический метаболизм). Первый включает расщепление различных субстратов для получения энергии, второй – синтез высокомолекулярных соединений, используемых для образования клеточных структур.

Типы питания. По происхождению клеточного углерода бактерии разделяют в основном на автотрофы и гетеротрофы.

• Автотрофия. Пищевые потребности некоторых бактерий ограничены. Для их роста достаточно внесения в среду NaCl, K₂HPO₄, FeCl₂, MgSO₄, (NH₄)₂SO₄. Автотрофные бактерии в качестве источника углерода используют двуокись углерода или карбонаты и не нуждаются в сложных органических соединениях (например, углеводах и белках). Они способны синтезировать все необходимые соединения из простых неорганических веществ.

• Гетеротрофия. Некоторые бактерии нуждаются в наличии по крайней мере одного органического соединения (обычно аминокислоте как источнике С и N или углевода в качестве источника углерода). Гетеротрофные бактерии в качестве источника углерода используют различные углеродсодержащие соединения – гексозы, многоатомные спирты, аминокислоты, органические кислоты и, реже, углеводороды.

• Гипотрофия является крайней степенью утраты метаболической активности. Гипотрофные бактерии обеспечивают свою жизнедеятельность, реорганизуя клеточные структуры или метаболиты хозяина.

• Ауксотрофия. Некоторые, особенно прихотливые, бактерии или мутанты с наследственными дефектами могут расти только в среде, дополненной определенными компонентами, которые сами синтезировать не могут. Бактерии, нуждающиеся в подобных факторах роста, называют ауксотрофами. Если ауксотрофы возникают в результате мутации, то «дикий» или основной тип, не нуждающийся в определенном факторе роста, называют прототрофным.

Источники энергии и доноры электронов. Поскольку при биохимическом окислении субстрата чаще всего происходит одновременный перенос двух электронов и двух протонов (Н⁺), отщепляющихся от субстрата, то термины «донор электронов» и «донор водорода» часто употребляют как синонимы. Бактерии-органотрофы в качестве доноров водорода используют органические соединения. Бактерии-литотрофы способны использовать неорганические доноры электронов (например, аммоний, нитриты, сероводород, сульфиты, серу, окись углерода, Fe²⁺).

Органотрофные бактерии используют углеводы и другие восстановленные органические соединения в качестве донора электронов (т.е. как источник энергии) и как исходный материал для формирования углеродного скелета во многих биосинтетических процессах.

Акцепторы электронов (акцепторы водорода) подвергаются восстановлению и играют важную роль в дыхании и брожении.

Аэробы. Терминальным акцептором электронов при аэробном дыхании является кислород.

Анаэробы. Терминальными акцепторами электронов при анаэробном дыхании могут служить нитраты, нитриты, сульфаты, сера, карбонаты, трехвалентное железо. Единственным органическим акцептором электронов в таком процессе может выступать фумарат.

Брожение. Акцепторами электронов в процессе брожения являются органические соединения (например, пируват, лактат и др.).

В зависимости от источника энергии выделяют хемотрофные (хемосинтезирующие) и фототрофные (фотосинтезирующие) бактерии.

Бактерии-фототрофы в качестве источника энергии используют свет (электромагнитное излучение). (цианобактерии, водоросли и зеленые растения).

Бактерии-хемотрофы получают энергию в результате окислительно-восстановительных реакций с участием субстратов, которые служат для них источником питания.

В соответствии с потребностями в кислороде бактерии разделяют на пять основных групп: облигатные (строгие) аэробы, облигатные анаэробы, факультативные анаэробы, микроаэрофильные бактерии, аэротолерантные бактерии.

Толерантность к кислороду обусловлена свойством бактерий ферментативным путем нейтрализовать токсичные кислородные продукты (например, супероксид-анион и Н₂О₂), образующиеся как побочные продукты при аэробном дыхании.

Супероксид дисмутаза конвертирует супероксид-анион (наиболее токсичный метаболит) в Н₂О_2. Фермент присутствует в аэробных и аэротолерантных бактериях.

Каталаза превращает Н₂О₂ в Н₂О и О₂. Фермент имеется у всех аэробных бактерий, но отсутствует у аэротолерантных организмов; у строгих анаэробов отсутствуют оба фермента.

Энергетический обмен. У бактерий выделяющаяся в процессе ферментативных катаболических реакций энергия аккумулируется в молекулах АТФ.

Бродильный метаболизм характеризуется образованием АТФ посредством фосфорилирования субстратов. Включает утилизацию органических соединений в качестве доноров и акцепторов электронов (т.е. часть молекул окисляется, часть восстанавливается, при этом освобожденная в процессе окисления субстрата энергия запасается в виде АТФ). Любое брожение проходит две стадии: первая (окисление) включает превращение глюкозы в пировиноградную кислоту, вторая (восстановление) – утилизацию водорода для восстановления пировиноградной кислоты. Сам процесс образования пировиноградной кислоты включает серию реакций, общих для брожения и аэробного дыхания.

Гликолиз доминирует у большинства аэробных и анаэробных бактерий и включает гликолитическую утилизацию глюкозы с помощью фермента фруктозо-6-фосфат дегидрогеназа. В конечном итоге образуется 2 моля АТФ на 1 моль глюкозы.

I фаза гликолиза включает превращение глюкозы в фруктозо-6-фосфат и (в конечном счете) в пируват (2 моля пирувата на 1 моль глюкозы).

II фаза гликолиза. Бактерии используют пируват во вторичных метаболических процессах, для окисления НАДН, образованного в I фазе гликолиза.

Механизмы питания бактерий

Питательные вещества из внешней среды поступают в бактериальную клетку с помощью трех основных механизмов: пассивной диффузии, облегченной диффузии и активного транспорта.

Пассивная диффузия осуществляется за счет различного содержания питательных веществ в среде и в клетке и происходит в направлении от большей концентрации к меньшей, т.е. по градиенту концентрации. Таким путем в клетку проникает (и покидает ее) вода вместе с растворенными в ней различными мелкими молекулами, способными проходить чрез мелкие поры мембраны. Для пассивной диффузии характерно отсутствие субстратной специфичности и она не требует затраты энергии.

Облегченная диффузия характеризуется выраженной субстратной специфичностью и протекает при обязательном участии специфических белков, локализованных в мембране. Синтез некоторых из них индуцируется соответствующими субстратами. Эти белки получили название пермеаз (от англ. permeate – проникать, проходить сквозь), они обладают субстратной специфичностью. На внешней стороне мембраны они распознают и связывают молекулу субстрата и обеспечивают ее перенос через мембрану. На внутренней поверхности мембраны комплекс пермеаза-субстрат диссоциирует, освободившаяся молекула субстрата включается в общий метаболизм клетки, а пермеаза повторяет очередной цикл переноса своего субстрата. Главное свойство пермеаз – способность проходить через мембрану как с присоединенной молекулой субстрата, так и без нее. Однако облегченная диффузия происходит только по градиенту концентрации, но не против него, поэтому она не требует затраты энергии.

Подобный тип транспорта характерен для клеток эукариот при поглощении сахаров. У прокариот единственным примером облегченной диффузии служит проникновение глицерина в клетки бактерий кишечной группы.

Активный транспорт. Растворенные вещества поступают в клетку против градиента концентрации, поэтому требует затраты энергии. В активном транспорте принимают участие особые связывающие белки, не идентичные пермеазам и не входящие в структуру мембраны, а локализованные в периплазматическом пространстве. У связывающих белков отсутствует каталитическая активность, но они обладают очень высоким сродством к определенным питательным веществам – к различным аминокислотам, сахарам, неорганическим ионам. Связывающие белки функционируют только в комплексе со специфическими пермеазами, осуществляющими активный перенос субстрата через мембрану. Метаболическая энергия, необходимая для этого, используется для снижения сродства пермеазы к своему субстрату на внутренней поверхности мембраны по сравнению с ее сродством к нему на внешней стороне мембраны. В результате этих превращений происходит изменение скорости выхода субстрата наружу, она становится во много раз меньше скорости его поступления в клетку. При этом механизме в клетку против градиента концентрации попадают химически не измененные питательные вещества. Однако многие сахара и их производные в процессе переноса могут фосфорилироваться и поступать в клетку в виде сахарофосфатов. Наружу они уже проникнуть не могут. Такая система называется фосфотрансферазная. Она широко распространена среди бактерий.

Рост бактерий. Под термином «рост» понимают необратимое увеличение количества живого вещества, наиболее часто обусловленное делением клеток. У бактерий выделяют увеличение количества клеток и увеличение клеточной массы. In vitro бактерии культивируют на питательных средах.

Для культивирования одних бактерий используют простые синтетические среды, содержащие только глюкозу, фосфаты, хлориды и сульфаты. Другим бактериям необходима комплексная среда, дополненная различными факторами роста, например экстракты тканей сердца или мозга.

По консистенции среды разделяют на жидкие (МПБ) и твердые (плотные), содержащие около 2% «уплотнителя» – агара (полисахарид, полученный из морских водорослей) – МПА. В некоторых случаях в качестве уплотнителя используется желатин. Среды с небольшим содержанием агара (0,6%) обозначают как полужидкие.

По целевому назначению различают простые питательные среды (МПБ, МПА), сложные или специальные (кровяной МПА, сахарный МПБ), элективные (селективные), на которых может расти только один вид бактерий, а рост других подавляется ингибиторами (щелочной МПА для холерного вибриона, гиперсолевые следы для стафилококка (ЖСА), среды с желчью для сальмонелл; и дифференциально-диагностические (среды Эндо, Левина, Плоскирева для кишечной группы бактерий, среды Гисса).

Факторы роста. Наиболее часто это витамины, пурины и пиримидины, принимающие участие в образовании большого количества ферментов, являясь коэнзимами.

Некоторые бактерии практически не способны к росту in vitro (например Mycobacterium leprae, хламидии), что считается проявлением крайней степени паразитизма и связано с утратой в процессе эволюции ряда важнейших ферментов, необходимых для самостоятельного роста и развития.

По способности к размножению при определенных температурах различают:

• Мезофильные бактерии. Они лучше всего растут в пределах 20-40°С, к ним относится большинство патогенных для человека микроорганизмов. Оптимальной температурой роста для них является 37°С, т.е. температура тела человека.

• Термофильные бактерии лучше растут при 50-60°С.

• Психрофильные бактерии предпочитают расти в интервале температур от 0 до 10°С. (Yersinia enterocolitica).

Размножение и рост бактерий. Бактерии размножаются поперечным (бинарным) делением с образованием двух идентичных особей. Их число растет в геометрической прогрессии 2⁰ → 2¹ → 2² → 2ⁿ . Грамположительные бактерии делятся посредством образования перегородки, вырастающей от клеточной стенки к центру. У бактерий рода Mycobacterium перегородка образуется внутри клетки, затем расщепляется на два слоя и разделяет одну клетку на две. Грамотрицательные бактерии (включая риккетсии) истончаются в центре и разделяются перегородкой на две клетки; исключение составляют бактерии рода Francisella, размножающиеся способом, напоминающим почкование у дрожжей.

Время генерации может быть коротким, например у псевдомонад 14 мин, либо продолжительным как у Mycobacterium tuberculosis – 16-24 часа. У большинства бактерий составляет 20-30 мин.

Регуляторное действие на рост бактерий оказывают качество питательной среды и условия выращивания. Рост бактерий в культуре может быть разделен по меньшей мере на 4 различные фазы в зависимости от утилизации бактериями составляющих питательной среды.

Лаг-фаза соответствует периоду интенсивного физиологического приспособления, включающего индукцию новых ферментов, синтез и сборку рибосом. Продолжительность адаптационного периода не превышает 4-5 часов.

Логарифмическая (экспоненциальная) фаза характеризуется максимальной скоростью клеточного деления. Продолжительность её 5-12 ч. Затем по мере утилизации среда истощается, в ней аккумулируются токсические продукты метаболизма, что проявляется снижением темпов размножения.

Стационарная фаза. Устанавливается равновесие между клеточным ростом и делением и процессом отмирания клеток. Спорообразующие бактерии родов Bacillus и Clostridium способны переходить в фазу споруляции.

Фаза спада (отмирания) включает период логарифмической гибели, переходящий в период уменьшения скорости отмирания бактерий. Иногда бактерии разрушаются под действием собственных ферментов.