oct03002

11

гиперболическую

ф орм у. В перв ы е

теоретические

основ ы

кинетики

ф ерм ентатив ного катализа бы ли разработаны Л.М

их аэлисом и М

.М ентен.

О ни предлож или

м атем атическое урав нение, в ы раж ающ ее зав исим ость

скорости ф ерм ентатив ной реакции v отконцентрации субстратаS:

v =

maxV ] S[

S +KS] [

гдеv – скоростьф ерм ентатив ной реакции; S – концентрациясубстрата,

Vmax – м аксим альнаяскоростьреакции, KM – константаМ

их аэлиса.

К онстантаМ

их аэлисаяв ляется м ерой сродств аф ерм ентак субстрату.

О на численно рав на концентрации

субстрата,

при

которой

скорость

ф ерм ентатив ной реакции рав наполов инем аксим альной скорости.

И з граф икаМ

их аэлиса– М

ентен трудно точно определитьК м

и Vmax, в

св язи с чем

им еются различны ем атем атическиепреобразов ания указанного

урав нения.

В частности, Лайнуив ер и Берк предлож или строить граф ик в

дв ойны х обратны х координатах . Т огдаурав нениеприм етв ид:

1

=

K

М

×

1

+

1

,

v

V

[S]

V

NAD+.

При изм ерении

скорости

данной реакции при различны х

концентрациях субстратаи постоянной концентрации NAD+ бы ли получены

данны е,

представ ленны е

в табл. 2.

О пределите граф ически KM и

К онцентрацияглутам ата,

Н ачальнаяскоростьреакции,

м м оль/л

E340/м ин

1,68

0,172

3,33

0,250

5,00

0,286

6,67

0,303

10,00

0,334

20,00

0,384

Процесс

ингибиров ания м ож ет бы ть обратим ы м

и необратим ы м .

О братим ы е

ингибиторы

бы в ают

конкурентного,

неконкурентного,

бесконкурентного

и см еш анного

действ ия.

Н екоторы е

ф ерм енты

ингибируютсяизбы тком субстрата.

К онкурентное

ингибиров ание

в озникает

тогда,

когда

ингибитор

К онкурентное ингибиров ание м ож ет

бы ть ослаблено или устранено

ув еличением концентрации субстрата. В

больш инств е случаев ингибиторы

Н еконкурентны й ингибитор

подав ляет

каталитическое

прев ращ ение

субстрата в

продукты

реакции.

В идим о, при неконкурентном

торм ож ении

ингибитор св язы в ается с ф ерм ентом на участке,

отличающ ем ся от центра

св язы в ания субстрата;

однако при этом

деф орм ирует этот центр,

подав ляя

его каталитическую ф ункцию.

К огда в

реакционной

среде нах одятся и

субстрат и ингибитор,

они присоединяются к ф ерм енту однов рем енно. В

присутств ии

неконкурентного

ингибитора

Kм

не

изм еняется,

а

Vmax

ум еньш ается.

Бесконкурентное ингибиров ание наблюдается в

том

случае,

когда

с ком плексом

ES, перев одя его в неактив ную ф орм у. Бесконкурентны й

ингибитор в

одинаков ой м ере ум еньш ает К м и м аксим альную скорость

реакции.

13

Ход работы .

При изм ерении кинетики

ф ерм ентатив ной

реакции в

зав исим ости от

концентрации субстрата в

присутств ие и

отсутств ии

ингибиторабы ли получены

данны е, представ ленны ев таблице3. О пределите

граф ически К м и Vmax в

отсутств ие ингибитора и в

присутств ии его.

О пределитетип ингибиров ания.

Т аблица3.

Скоростьф ерм ентатив ной реакции в отсутств иеи в присутств ии

ингибитора

К онцентрация

Скоростьреакции, м км оль/м ин

субстрата, м км оль/л

Без ингибитора

Сингибитором

3

10,4

4,1

5

14,5

6,4

10

22,5

11,3

30

33,8

22,6

90

40,5

33,8

Р абота 7. Ф ермен ты поджелудочн ой железы . О пределен ие

активн остиамилазы в сы воротке крови

Ф ункции подж елудочной ж елезы . Подж елудочная

ж елеза яв ляется

порции пищ и.

В

тонком

киш ечнике продолж ается перев арив ание белков ,

начав ш еесяв ж елудке.

Перев арив ание

белков .

Поступление

ам инокислот

в

дв

енадцатиперстную

киш ку

в ы зы в ает

осв обож дение

горм она

х олецистокинина,

которы й

стим улирует секрецию

нескольких

ф ерм ентов

подж елудочной

ж елезы .

Э то трипсин,

х им отрипсин, карбоксипептидаза и

эластаза.

О ни

в ы рабаты в аются экзокринны м и

клеткам и

подж елудочной

ж елезы в

в идеф ерм ентатив но неактив ны х предш еств енников (зим огенов ) -

трипсиногена,

х им отрипсиногена,

прокарбокси-пептидазы

и

проэластазы .

Благодаря

этом у

подж елудочная

ж елеза не

разруш ается

ф ерм ентам и.

Зим огены

актив ируются в

тонком

киш ечнике

путем

ограниченного

протеолиза.

Т рипсиноген прев ращ ается в актив ную ф орм у под

действ ием

энтерокиназы ,

протеолитического

ф ерм ента,

секретируем ого

клеткам и

киш ечного

эпителия. О бразов ание трипсина обуслов лено

отщ еплением

трипсин. Т рипсин гидролизует пептидны е

св яз и, образов анны е

карбоксильны м и группам и лизинаи аргинина.

Хим отрипсиноген, как и

проэластаза

и

прокарбоксипептидаз а,

прев ращ ается в актив ны й ф ерм ент под

действ ием

трипсина.

М олекула

х им отрипсиногена представ ляет

собой

одну

полипептидную

цепь с

гидролизует

пептидны е св язи,

образов анны е

остаткам и

ф енилаланина,

тирозина и

триптоф ана.

Э ластаза

гидролизует пептидны е

св язи,

образов анны епролином . К арбоксипептидазаотщ епляетам инокислоты

отС-

концаполипептидов .

Д еградация коротких пептидов в

тонком

киш ечнике осущ еств ляется

другим и пептидазам и. В

результатебелки прев ращ аются в см есьсв ободны х

ам инокислот,

которы е

транспортируются через эпителиальны е клетки,

в ы стилающ иетонкиекиш ки, и переносятсякров ью в печень.

Перев арив ание углев одов .

К рах м ал

и

гликоген

расщ епляются

ф ерм

ентам и

до D-глюкоз ы .

Э тот процесс

начинается в о рту в о в рем я

слюнны м и ж елезам и. А м илаза гидролизует α-(1-4)-гликозидны е св язи

в

крах м але и в гликогене. При этом образуется см есь м альтозы , глюкозы

и

олигосах аридов . Перев арив ание углев одов продолж ается и зав ерш ается в

тонком киш ечникепод действ ием ам илазы

подж елудочной ж елезы .

Перев арив аниетриацилглицеролов (нейтральны х ж иров , состоящ их из

тонком

киш ечнике, куда из

глицерина и ж ирны х

кислот)

начинается в

подж елудочной

ж елез ы

поступает

зим оген

пролипаза.

Пролипаза

прев ращ ается в

актив ную липаз у в

присутств ии ж елчны х

кислот и белка

колипаз ы . К ом плекс липазы ,

ж елчны х кислоти колипазы

присоединяется к

капелькам

триацилглицеролов и катализируетгидролитическоеотщ епление

одного или обоих крайних

остатков

ж ирны х

кислот с образов анием см еси

св ободны х

ж ирны х

кислот в

в иде их

Na+ или K+-солей

(м ы л)

и

2-

м оноацилглицеролов .

О бразов ав ш иеся

м ы ла

и

нерасщ епленны е

ацилглицеролы

эм ульгируются

в

в иде м елких

капелек

под

действ ием

перистальтики

(перем еш ив ание дв иж ением

киш ечника),

а

такж е

под

в лиянием

солей

ж елчны х

кислот,

м оноацилглицеролов

и ф осф олипидов ,

которы е

яв ляются

ам ф ипатическим и

соединениям и

и

потом у

ф ункционируют как

детергенты .

Д етергенты

располагаются на границе

раздела ф аз

ж ир-в ода и

стабилизируют эм ульсию.

Ж ирны е кислоты

и

м оноацилглицеролы из этих капелек поглощ аютсякиш ечны м и клеткам и.

К ром е

перечисленны х

пищ ев арительны х

ф ерм ентов ,

сок

подж елудочной ж елез ы

содерж итряд других : карбоксиэстеразы

(отщ епляют

глицеринотм оноацилглицерола), ф осф олипаз ы

(расщ епляютф осф олипиды ),

х олестеролэстераза

(расщ епляет

эф иры

х олестерина),

рибо-

и

дезоксирибонуклеазы

(разруш аютнуклеинов ы екислоты ).

О стры й панкреатит –

неинф екционное в оспаление подж елудочной

ж елезы ,

которое наступает

в

результате действ ия

любы х

причин,

в ы зы в ающ их :

- пов ы ш енную секрецию панкреатического сока и затруднение его

оттока с пов ы ш ением

дав ления в

панкреатических

протоках .

При

этом

происх одитнаруш ением етаболизм аклеток и в ы х од ф ерм ентов из лизосом

в

цитоплазм у. Лизосом альны еф ерм енты

м огутактив иров атьзим огены ;

15

-

заброс

в

протоки

пов реж дающ их

клетки

и

актив ирующ их

панкреатическиеф ерм енты

в ещ еств ;

-

прям ое пов реж дение панкреацитов (заболев ания ж елчев ы в одящ их

путей

или

дв енадцатиперстной

киш ки,

избы точное питание ж ирной и

ж ареной пищ ей, прием

алкоголя, наруш ения кров ообращ ения в организм еи

в ж елезе,

трав м ы

подж елудочной

ж елезы ,

отрав ления,

в ирусны е

заболев ания).

К ом бинация нескольких пусков ы х

ф акторов

заболев ания станов ится

толчком для актив ации протеолитических ф ерм ентов

в нутри протоков и

сам оперев арив ания

подж елудочной

ж елез ы .

А ктив ны е

панкреатические

ф ерм енты

не только

действ уют м естно, но

и

поступают з а пределы

подж елудочной

ж елезы

–

в

окруж ающ ие ткани, в

полость брюш ины , по

портальной

систем е в

печень, по лим ф атической

систем е в

кров ь. Э то

перв ичны еф акторы

агрессии.

В торичны е ф акторы

агрессии –

кинины

(брадикинин, серотонин,

гистам ин –

горм оноподобны е в ещ еств а м естного действ ия),

образов ание

которы х актив ируется под действ ием

трипсина. О ни пов ы ш аютсосудистую

проницаем ость с ф орм иров анием

отека ж елез ы .

Ф осф олипаз а стим улирует

в ы работку простагландинов

(ещ е одна группа горм оноподобны х

в ещ еств

липидной

природы ),

которы е

усилив ают

секреторную

актив ность

подж елудочной

ж елезы

и

проницаем ость м ем бран.

О тм ечается

такж е

усиление пероксидного окисления липидов ,

сниж ение антиоксидантной

защ иты

2+

клеток подж елудочной ж елезы и накоплениев них ионов Са .

Ф акторы

агрессии

третьего

порядка

–

иш ем ические

токсины

панкреатического происх ож дения, наприм ер,

ф актор депрессии м иокарда,

в ы зы в ающ ий наруш ениясердечной деятельности.

Перв ы м и

органам и-м иш еням и ф ерм ентной и токсической

агрессии

оказы в аются печеньи легкие, затем

сердцеи центральная нерв ная систем а,

затем

почки.

Разв ив аются

м оторны е

наруш ения ж елудочно-киш ечного

тракта.

Под

в лиянием

лечения

и

м ех анизм ов

тканев ой

защ иты

м ож ет

произойти частичноев осстанов лениеструктуры

и ф ункций подж елудочной

ж елезы

и других пов реж денны х

органов . М

ож ет разв иться х ронический

панкреатит, при котором

в стадии обостренияклетки подж елудочной ж елезы

погибают,

а в

стадии

затух ания

обострения

на их

м есте разв ив ается

При изучении в неш несекреторной ф ункции подж елудочной

ж елезы чащ е

в сего определяют актив ность ф ерм ентов (ам илазы , липазы

и трипсина) в

изм енения

актив ности ам илазы , липазы

и трипсина в кров и после

стим уляции

подж елудочной ж елезы

секретином и х олецистокинином ;

уров ень эластазы и х им отрипсина в кале;

исследуют ф ункции околоуш ной

ж елезы , в которой при х роническом

панкреатитем огутпроисх одитьтеж е

α-ам илаза (К Ф

3.2.1.1) катализирует гидролиз крах м ала,

гликогена и

родств енны х поли-

и олигосах аридов с образов анием

м альтозы ,

секретируется подж елудочной

и

слюнны м и ж елезам и,

в ы яв лен такж е в

печени, легких , почках , киш ках .

Принцип м етода:

α-ам илаза катализирует гидролиз нераств орим ого

цв етного

крах м ального

субстрата с образов анием

раств орим ого

синего

красителя

пропорционально

каталитической

актив ности

ф ерм ента.

К онцентрацию красителяопределяютф отом етрически при 590 нм .

Реактив ы : 1.

Ц в етной

крах м альны й

субстрат (36 г/л) в

ф осф атном

буф ере (60 м м оль/л) рН

7,0,

содерж ащ ем

натрий х лористы й 9 м м оль/л. 2.

О саж дающ ий

раств ор:

м агний

сернокислы й

1,85

м оль/л,

кислота

сульф осалицилов ая2 м м оль/л, х елатон3 - 1,3 м м оль/л.

Ход работы представ ленв таблице4.

Т аблица4.

Ход определенияам илазы в сы в ороткекров и

Реагенты , м л

Проба

К онтроль

Субстрат(№ 1)

1,0

1,0

Подогрев ают5 м инпри 370С

Сы в оротка

0,1

-

Д истиллиров аннаяв ода

-

0,1

И нкубируютточно15 м инпри 370С

О саж дающ ий реактив (№ 2)

2,0

2,0

Перем еш ив ают. Через

15

м ин центриф угируют 5 м ин. при 3000

об/м ин. или ф ильтруют. И зм еряют оптическую плотность надосадочной

ж идкости пробы

(А ) против

надосадочной ж идкости контроля.

Д лина

в олны 590 нм .

Расчет.

К аталитическую

концентрацию

α-ам илаз ы

нах одят по

прилож енной

калибров очной

таблице, исх одя из

полученной

оптической

плотности (А ).

Н орм альны ев еличины : 2,3-5,8 м ккат/л.

Прим ечания.

Пробы с

экстрем ально в ы сокой концентрацией разв одят

ф изиологическим

раств ором

NaCl, результат ум нож ают на разв едение.

Посуданедолж насодерж атьдетергенты . Результаты

м огутбы тьискаж ены

следам и слюны

и пота. Следуетф ильтров атьчерез бум аж ную в ату.

17

Д иагностическое значение теста: А ктив ность ам илазы

в сы в оротке

кров и

пов ы ш ается при остром

панкреатите, паротите,

х роническом

непрох одим ости тонкого киш ечника,

перф орации язв ы , разры в е м аточной

трубы . Сниж ение актив ности ф ерм ента наблюдается при

депрессии,

аутоим м унном заболев ании слюнны х

ж елез, панкреонекрозе,

отрав лении

м ы ш ьяком , барбитуратам и.

моче. К ачествен н ы е реакциин а кетон овы е тела

М

етаболизм глюкозы в клетках организм ачелов ека. В

клетки тканей

пищ и,

так и

организм а глюкоза м ож ет поступать как экзогенная из

образов анная эндогенно из гликогена (в процессе гликогенолиза)

или из

других

субстратов (из лактата, глицерата, ам инокислот

в результате

глюконеогенеза).

За перенос глюкозы в клетки отв ечают транспортны е

белки. Д ля поступления глюкозы

в клетки больш инств а тканей организм а

нуж ен инсулин.

И нсулин – это

горм он пептидной природы , которы й

инсулиннезав исим ы е ткани

–

слизистая

киш ечника,

нерв ная

ткань,

эритроциты

и сем енники.

В

клетках глюкоза

ф осф орилируется

с

пом ощ ью

ф ерм ента

гексокиназы ,

образуя

глюкозо-6-ф осф ат.

Глюкозо-6-ф осф ат

яв ляется

субстратом

нескольких путей м етаболизм а.

С уб с т рат ная

регуляц и я .

Т ипы

регуляции

углев одного

обм ена.

О снов ны м

ф актором ,

определяющ им

м етаболизм

глюкозы , яв ляется ее

концентрация в

кров и (гликем ия). При уров не гликем ии м еньш ем

5,5-5,8

м м оль/л, печеньпостав ляетглюкозу в кров ь, при больш ем

уров не, наоборот,

преобладаетсинтез гликогенав печени и м ы ш цах .

В

клетках слизистой киш ечника,

почках и печени содерж ится ф ерм ент

глюкозо-6-ф осф атаза.

Э тот ф ерм ент отщ епляет ф осф атную

группу от

глюкозо-6-ф осф атас образов анием

глюкозы . Св ободнаяглюкозапоступаетв

кров ь.

Т аким

образом ,

в ы ш еперечисленны е ткани участв уют в

регуляции

концентрации глюкозы

в кров и.

Нервная

регуляц и я .

В озбуж дение сим патических

нерв ны х

в олокон

прив одит к

осв обож дению

адреналина из

надпочечников .

А дреналин

кров и. Раздраж ение парасим патических нерв ны х

в олокон сопров ож дается

усилением в ы деления инсулина подж елудочной

ж елезой, поступлением

глюкозы в клетку и сниж ением ееуров няв кров и.

18

П очечная

регуляц и я . В клубочках почек глюкозаф ильтруется, затем в

проксим альны х

канальцах реабсорбируется.

При прев ы ш ении в сы в оротке

уров ня 8,8-9,9

м м оль/л (почечны й порог)

глюкоза в ы деляется с м очой

Горм ональная регуляц и я . Н ауров еньглюкоз ы

в кров и в лияетш ирокий

спектр горм онов , но только инсулин в ы зы в аетсниж ениеуров ня глюкозы

в

кров и –

гипогликем ию.

И нсулин

синтезируется

в в иде

неактив ного

проинсулина,

в этом

в иде

он

накаплив ается

в

β-клетках

остров ков

Лангерганса подж елудочной

ж елезы .

В

результате частичного протеолиза

проинсулина

образуется

актив ны й

инсулин

и

С-пептид.

И нсулин

не

проникает в

клетки;

на пов ерх ности

клеток

сущ еств уют рецепторы

к

инсулину.

И нсулин

усилив ает

поступление

в

клетки глюкозы , К +

и

ам инокислот,

актив ирует м ногие в нутриклеточны е ф ерм енты .

И нсулин

усилив ает синтез белков

(протеогенез),

липидов

(липогенез)

и гликогена.

(гликогенолиз) и синтез

глюкозы

(глюконеогенез). Глюкагон оказы в ает

эф ф екты , против ополож ны едейств ию инсулина.

Сах арны й

диабет.

Сах арны й

диабет

–

это

группа

обм енны х

заболев аний,

х арактеризующ их ся

гипергликем ией,

которая

яв ляется

результатом

сниж ения

синтез а или

эф ф ектив ности

действ ия

инсулина.

В ы деляютдв атипадиабета.

Д иабета

1

типа

(инсулинозав исим ы й

диабет)

х арактеризуется

абсолютны м

деф ицитом

секреции инсулина. Чащ е в озникает в

м олодом

в озрасте. Лица с в ы соким

риском

разв ития этого типа диабетам огут бы ть

идентиф ициров аны

по наличию в кров и антителк клеткам панкреатических

остров ков и по генетическим

м аркерам . Причина этого типа диабета –

разруш ение

клеток

остров ков

подж елудочной

ж елезы ,

обы чно

аутоим м унное.

Ф акторы

риска

-

в ирусны е

инф екции, в оздейств ие

х им ических

в ещ еств ,

трав м ы ,

в оспаление (панкреатит)

или

удаление

подж елудочной ж елезы .

Д иабет2 типа(инсулинонезав исим ы й диабет)

х арактеризуется

Н ачинается

обы чно у

относитель-ны м

деф ицитом

секреции инсулина.

в зрослы х .

О тм ечается

сниж ение

чув ств ительности

к

инсулину

прояв ляться на рецепторном и пострецепторном уров не. В кров и м огут

обнаруж ив аться антитела к

клеточны м рецепторам

инсулина. В

больш ей

степени наследуется, чем

диабет 1 типа. Ф акторы

риска –

ож ирение,

гипертоническаяболезнь, атеросклероз .

Н аруш ения м етаболизм а при сах арном диабете.

У м еньш ение или

прекращ

ение поступления

глюкозы

в

инсулин-зав исим ы е клетки

сопров ож дается пов ы ш ением

ее уров ня в

кров и. При

этом пов ы ш ается

19

в ещ еств ом и

прив одит к

поступлению в оды в

клетки. В

частности, с

накоплением

сорбитола

св язано в озникнов ение

катаракты

у больны х

диабетом .

белков

и других

азотсодерж ащ их

м олекул. О бразующ иеся

ком плексы

назы в аются

ф руктозам ины .

Ф ункции

гликозилиров анны х

белков

наруш аются;

так,

гликозилиров анны й гем оглобин прочнее

св язы в ает

кислород и х уж еотдаетего тканям . В озникаютиш ем ия тканей,

неф ропатия

(патология почек), ретинопатия

(патология сетчатки глаза),

ангиопатия

(пов реж дениесосудов ) и другиепатологическиесостояния.

Гипергликем ия прив одитк глюкозурии – в ы делению глюкозы

с м очой.

Т ак как

глюкоза осм отически

актив на,

происх одит ув еличение объ ем а

в ы деляем ой м очи (пов ы ш ениедиурез а) и усилениеж аж ды .

У силение распада липидов

прив одит к образов анию

больш ого

ам инокислот путем глюконеогенеза

образуется глюкоза, при этом

пов ы ш ается уров ень м очев ины

в кров и,

которая образуется из ам иногрупп

ам инокислот.

Биох им ическиеанализы

при сах арном

диабете.

Ди агнос т и ка с ахарного

ди аб ет а.

В

диагностик

е сах арного диабета

Ди агнос т и ка ком пенс ац и и

с ахарного

ди аб ет а.

О пределяют

концентрации

кетонов ы х тел в кров и и в м оче, лактата в

кров и (для

установ ления

степени иш ем ии),

ф руктозам инов

и гликозилиров анного

каталитическом действ ии глюкозооксидаз ы

образуется

экв им олярное

количеств о пероксидав одорода. Под действ ием

пероксидазы

H2O2 окисляет

4-ам ино-антипирин в присутств ии ф енолов

в окраш енное соединение.

пробы при длинев олны

490-540 нм . О краскапробстабильнав течение2 ч.

после инкубации при

услов ии предох ранения

от прям ого в оздейств ия

солнечны х лучей.

Т аблица5.

Ход определенияглюкозы

Реактив ы

О пы тная

К алибров очная

К онтрольная

проба, м л

проба, м л

проба, м л

Рабочий реагент

2,0

2,0

2,0

Сы в ороткакров и

0,02

-

-

Стандартны й раств ор

-

0,02

-

H2O

-

-

0,02

Расчет. Расчет

концентрации

глюкозы в

анализируем ы х пробах

опы тной пробы ; Е станд

– оптическая плотность калибров очной пробы ; 10 –

концентрацияглюкоз ы

в стандартном раств оре, м м оль/л

Д иагностическое значение теста.

Глюкоза - основ ной ком понент

энергетического обм ена в организм е.

Н орм альное содерж ание в кров и

состав ляет3,33 – 5,55 м м оль/л, в сы в ороткеи плазм е- 3,8

– 6,2 м м оль/л.

Гипергликем ия (пов ы ш ение концентрации глюкоз

ы в кров и) м ож ет

Гипергликем ия

м ож ет

наблюдаться

при

м ногих

патологических

состояниях : сах арном

диабете,

остром панкреатите, трав м ах ,

сотрясениях и

заболев аниях голов ного м озга, токсикозах

и отрав лениях ,

псих ическом

в озбуж дении, пов ы ш енной горм ональной актив ности коры

надпочечников и

передней доли гипоф из аи некоторы х других патологиях .

Гипогликем ия (сниж ение концентрации глюкозы в

сы в оротке кров и)

бы в аетпри передозиров кеинсулина, заболев аниях

подж елудочной ж елезы ,