Medgenetika_glava1_2

31

3.ВИРТУАЛЬНАЯ ЛАБОРАТОРИЯ. САУЗЕРН-БЛОТ

1.Введение

Саузерн-блоттинг (Southern Blot Analysis) применяется для детектирования определённых последовательностей ДНК в исследуемых образах. Метод первоначально был разработан в 1975 английским биологом Эдвином Саузерном, в честь которого и был в последствие назван. По аналогии Саузерн блота были разработаны и названы методы переноса белка — Вестерн блот и РНК — Нозерн блот.

В основе метода Саузерн-блоттинга лежит принципиальная возможность переноса электрофретически разделённых фрагментов ДНК из агарозного (полиакриламидного) геля на нитроцеллюлозную мембрану и гибридизации нуклеотидов искомой ДНК с олигонуклеотидным ДНКзондом. Сформировавшийся комплекс позволяет ответить на вопрос: присутствует или нет в исследуемом образце искомый участок молекулы ДНК. В настоящее время метод блота по Саузерну применяется как в эксперименте, так и в лабораторной диагностике:

•Скрининг клеток на присутствие рекомбинантных (клонированных) вставок;

•Выявление трансгенных растений и животных;

•Выявление маркёрных генов опухолевых клеток;

•Выявление различных хромосомных перестроек, точечных генных мутаций;

•Выявление вирусной ДНК в исследуемом образце (кровь, слюна спинномозговая жидкость и др.)

•Перинатальная и постнатальная диагностика наследственных заболеваний человека

2. Протокол блоттинга по Саузерну (рис. 1-15).

1.Забор и подготовка материала для исследования направлены на максимальное сохранение целостности геномной ДНК в забранном для анализа биоматериале (кровь, биопсия). До анализа биологический материал хранится в холодильной камере при температуре от - 20 до -80 оС, либо в жидком азоте при -195,75 оС, при этом стоит избегать повторных циклов оттаивания и замораживания для исключения разрушения молекул ДНК.

2.Выделение геномной ДНК включает разрушение ядерной оболочки клеток, инактивацию эндогенных ДНКаз (ферментов, расщепляющих молекулу ДНК), деградацию молекул РНК, очистку от белковых и липидных примесей.

32

Рис. 1-15. Блоттинг по Саузерну.

33

3. Разрезание (расщепление) молекул ДНК на фрагменты выполняют с помощью специальных ферментов — рестриктаз. Рестриктазы (эндодезоксирибонуклеазы рестрикции) относятся к ферментам класса гидролаз, катализирующих гидролиз фософодиэфирных связей. Первые ферменты EcoB и EcoK были выделены из штамма К12 кишечной палочки Е.соli. Ферменты имеют высокую специфичность к определённой последовательности ДНК, но расщепляют её неспецифично. Позднее были выделены ферменты, обладающие не только высокой специфичностью узнавания, но также специфично расцепляющие молекулу ДНК, например, BclI, источником которой является Bacillus caldolyticus. BclI расщепляет ДНК в участках :

5’-…Т|ГАТЦА…-3’ 3’-…AЦТАГ|T…-5’

4.Разделение фрагментов ДНК в зависимости от их размера (длины) и формы выполняют методом электрофореза в 1% агарозном геле. Процесс разделения основан на способности молекул ДНК мигрировать в толще агарозного геля под действием приложенного электрического поля. Вследствие того, что сахарофосфатный остов ДНК несёт отрицательный заряд, то все фрагменты ДНК движутся от катода - по направлению к положительно заряженному аноду.

5.Перенос фрагментов ДНК на мембранный фильтр (блоттинг).

Нитроцеллюлозную (или нейлоновую) мембрану помещают сверху агарозного геля. Для успешного переноса необходим плотный контакт геля и мембраны. Капиллярными силами ДНК из участка с высоким содержанием воды (гель) переносится в зону с низким содержанием воды (мембрана). При этом полианионная ДНК связывается с положительно заряженной мембраной силами ионообменных взаимодействий.

6.Выбор ДНК-зонда. Для детекции целевого фрагмента ДНК используют короткие фрагменты ДНК (20-30 п.н.), строго комплементарные последовательности ДНК-мишени и содержащие специфическую метку (радиоактивные изотопы, флуоресцеины, биотин и др.). Выбор метки зависит от нескольких факторов, таких как: природа зонда, необходимой чувствительности, легкости в использовании, и времени на проведения исследования.

7.Денатурация проводится с целью получения одноцепочечных молекул ДНК, способных комплементарно взаимодействовать между собой. Денатурацию фрагментов геномной ДНК в мембране выполняют с помощью щёлочи, а ДНК-зодна — путем нагревания до 95-98 оС.

34

8.Гибридизация. Одноцепочечные молекулы нуклеиновых кислот по правилу Уотсона–Крика (исследуемая ДНК и ДНК-зонд) комплементарно спариваются между собой, образуя ДНК–ДНК дуплексы. Процесс гибридизации происходит при 65°С в течение 24 часов.

9.Отмывка выполняют для удаления не связавшихся молекул ДНК-зон- дов. В результате на мембране остаются ДНК-зонды, гибридизированные с комплементарной и представляющей интерес последовательностью ДНК.

10.Визуализацию образованных дуплексов проводят с помощью метода, соответствующего выбранной метке. Маркированные участки на мембране соответствуют расположению меченых (искомых) фрагментов ДНК.

3. Косвенная ДНК-диагностика серповидноклеточной анемии

На первомэтапе диагностики необходимо получитьобразец крови или волосяного фолликула и выделить геномную ДНК по стандартной методике. После чего ДНК подвергают рестрикции ферментом, расщепляющим ДНК в сайте рестрикции 5’-…ГЦГЦ…-3’на фрагменты разной длины (рис. 1-16), разделяют по молекулярной массе с помощью гель электрофореза, переносятся на мембрану и гибридизируют с специфическим ДНК-зондом. В данном случае целесообразно использовать ДНК-зонд, содержащий ГЦГ последовательностьдля комплементарного спаривания с ЦГЦ последовательностью фрагментированной ДНК.

Рис. 1-16. Сайты рестрикции полиморфного маркёра. ДНК гена гемоглобина каждого члена семьи подвергается рестрикции эндонуклеазами. Фермент разрезает ДНК между первым Г и первым Ц нуклеотидами в сайте рестрикции (указан стрелкой). В первом образце ДНК разрезается на три фрагмента, во втором — на два. [из: http:// www.bio.davidson.edu/courses/molbio/molstudents/spring2003/williford/ assignment1_home.htm]

35

Нормальный аллель гена HbAимеет длину 1,15 kb, а ген HbS — 1,35 kb (рис. 1-17). Пациент гомозиготный по гену HbS (S/S) имеет только один фрагмент ДНК длиной 1,35 kb, а пациенты гетерозиготные по признаку болезни (A/S) имеют два фрагмента — 1,35 kb и 1,15 kb. У пациентов без отягощения наследования мутантного гена(A/A) фрагмент ДНК имеет длину в 1.15 kb.

Анализ ПДРФ не может с точностью в 100% указать кто из членов семьи гомо-, а кто гетерозиготен по мутации гена гемоглобина. Для этого должна быть абсолютная уверенность, что ген заболевания и ПДРФ маркёр сцеплены. Кроссинговер может «разлучить» мутантный ген гебоглобина и полиморфный маркёр.

Рис. 1-17. Генеалогический метод и ПДРФ анализ наследования полиморфного маркёра гена гемоглобина. Анализ блоттинга по Саузерну выявил маркёр болезни у родителей и двух сибсов больного. HbAсоответствует нормальному (дикому) типу гена, Hb S — мутантному гену. 1 kb (kilobase) равен 1000 пн. [из: http://www.bio.davidson.edu/courses/ molbio/molstudents/spring2003/williford/assignment1_home.htm]

36

ТИПОВЫЕ ТЕСТОВЫЕ ВОПРОСЫ

Пояснение. За каждым из перечисленных вопросов или незаконченных утверждений следуют обозначенные буквой ответы или завершения утверждений. Выберите один ответ или завершение утверждения, наиболее соответствующее каждому случаю.

1.Недостаток косвенной ДНК-диагностики.

А.Требуется анализ ДНК нескольких членов семьи из разных поколений.

Б. У лиц из группы риска необходимо предварительно диагностировать заболевание, хотя бы у одного члена родословной.

В. Точность ДНК-диагностики составляет менее 97%.

Г. Неприменима к диагностике единичных (случайных) случаев заболевания.

Д.Все утверждения верны.

2.Пробанд – это:

А. Пациент, обратившийся к врачу.

Б. Пациент, впервые попавший под наблюдение врача – генетика. В. Здоровый человек, обратившийся в медико-генетическую консуль-

тацию.

Г.Человек, с которого начинается сбор информации для составления его родословной.

Д.Отец пациента с наследственным заболеванием.

3.Сибсы — это:

А. Все родственники пробанда. Б. Дети одной родительской пары.

В.Только братья или только сестры одной родительской пары. Г. Родственники пробанда по материнской линии.

Д. Родственники пробанда, обследованные врачом.

4.Выберите характерный признак митохондриального типа наследования.

А. Болезнь передается только по материнской линии.

Б. Заболевание чаще встречается у женщин и реже у мужчин.

В.Болезнь передается только дочерям.

Г. Больные женщины передают заболевание только в 50% случаев,

Д. Все дети больных отцов здоровы.

5.Укажите признаки, нехарактерные для аутосомно-рецессивного типа наследования:

А. Заболевание одинаково часто встречается у мужчин и женщин. Б. У больных родителей могут быть здоровые дети.

В. Женщины болеют чаще мужчин.

37

Г. Родители больного здоровы.

Д.Родители больного являются близкими родственниками.

6.Полиморфные маркёры применяются везде, кроме:

А. Косвенной ДНК-диагностики

Б.Клинико-генеалогическом методе В. Выявлении хромосомных аббераций Г. Составлении генетических карт Д. Выявлении геномных заболеваний

7.Определить тип наследования признака в семье, где отец болен, мать здорова, а все дети (сыновья и дочери) здоровы:

А. Рецессивный, сцепленный с Х-хромосомой.

Б.Доминантный, сцепленный с Х-хромосомой.

В.Доминантный, с пенетрантностью менее 50%. Г. Сцеплен с Y-хромосомой.

Д. Ни один из вышеперечисленных ответов.

8.Определить тип наследования признака в семье, где отец болен, мать здорова, все сыновья здоровы, а все дочери больны?

А. Аутосомно-доминантный. Б. Аутосомно-рецессивный.

В.Рецессивный, сцепленный с Х-хромосомой.

Г.Доминантный, сцепленный с Х-хромосомой. Д. Сцеплен с Y-хромосомой.

9.Для наследования признака по доминантному типу характерно:

А. Признак наблюдается в каждом поколении.

Б. Заболевание встречается через одно или несколько поколений. В. У больного отца все сыновья здоровы.

Г.Заболевание встречается чаще при близкородственных браках. Д. Если родители больны, то все дети в их семье тоже больны.

10.Метод блоттинга по Саузерну применяется в лабораторной диагностике для:

А. Скрининга клеток на присутствие ДНК-мишени.

Б. Выявления генетически модифицированных организмов. В. Выявления онкогенов.

Г.Выявления различных хромосомных аберраций перестроек.

Д. Во всех вышеперечисленных случаях.

38

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1.В чем заключаются трудности изучения генетики человека?

2.Сколько фенотипов человека известно на сегодняшний день?

3.Что такое родословная?

4.В чем заключается удобство работы с человеком?

5.Для чего применяется клинико-генеалогический метод?

6.В чем достоинство и недостатки клинико-генеалогического метода?

7.Каковы принципы составления родословной?

8.В каких случаях составляется родословная?

9.С кого начинается составления родословной? Его обозначение.

10.Кто включается в состав родословной?

11.Как обозначаются члены родословной и поколения?

12.Почему важно выявить характер признака при составлении родословной?

13.Что такое наследственное заболевание?

14.Какие существуют типы наследования?

15.Характеристика аутосомно-доминатного типа наследования. Примеры.

16.Характеристикааутосомно-рецесивного типанаследования. Примеры.

17.Характеристика доминатного Х- сцепленного типа наследования.

Примеры.

18.Характеристика рецессивного Х-сцепленного типа наследования. Примеры.

19.Характеристика Y- сцепленного типа наследования. Примеры.

20.Сцепленные с полом заболевания. Их выявление и риск носительства.

21.Проявление Х-сцепленного заболевания у мужчин и женщин.

22.Характеристика цитоплазматического типа наследования. Примеры.

23.Что такое инбридинг?

24.В чем состоит опасность близкородственных браков?

25.От чего зависит увеличение шанса проявления рецессивного заболевания?

26.От чего зависит риск развития определенного заболевания?

27.В чём опасность однонуклеотидных замнов в ДНК?

28.Что такое пренатальная и постнатальная ДНК-диагностика?

29.Что такое косвенная ДНК диагностика?

30.Области применения косвенной ДНК-диагностики, основные недостатки.

31.Назовите основные методы косвенной ДНК-диагностики?

39

32.Чем обусловлено явление полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ)?

33.Что такое эндонуклеаза рестрикции?

34.Что такое ДНК-зонд и для чего его применяют?

35.В чём заключается метод блоттинга по Саузерну?

36.Что такое полиморфные маркёры?

37.В каких случаях лабораторной диагностики применяются полиморфные маркёры?

38.Какая связь между косвенной ДНК-диагностикой и клинико-генеа- логическим методом?

39.Что Вы знаете про Виктора Мак Кьюсика?

40.Какое количество генов выявлено в геноме человека на сегодняшний день?

41.Сколько фенотипов с установленным типом наследования известно на сегодняшний день?

42.Что такое митохондриальные заболевания и как они наследуются?

43.Как наследуется митохондриальная ДНК?

44.Что кодирует митохондриальная ДНК?

45.Обоснуйте гомологию междумитохондриальной ДНКи плазмидами.

46.Какие заболевания диагностируются с помощью косвенной ДНКдиагностики?

47.Что такое генное зондирование?

48.В каких случаях применяются ДНК- и РНК-зонды?

49.Какие метки включают в ДНК-зонды?

50.Назовите основные этапы блоттинга по Саузерну.

40

СПРАВОЧНИК ТЕРМИНОВ

Аллель — различные формы одного и того же гена, расположенные в одном участке хромосомы (локусе) и определяющие альтернативные варианты признаки.

Авторадиография — метод, при котором молекулы белка, нуклеиновых кислот или иных соединений метят радиоактивным изотопом, с последующим его выявлением по характеру засвечивания фотоэмульсионного слоя на плёнке.

Аозооспермия — заболевание, при котором в эякуляте отсутствуют сперматозоиды. Одна из причин мужского бесплодия.

Атаксия Фридриха — тяжелая форма мышечной дистрофии, сопровождающаяся расстройствами координации движений.

Аутосома — хромосома, не относящаяся к половым Х- и Y- хромосомам.

Блоттинг (англ. blotting — впитывание, промокание промакивание) — перенос фрагментов полимерных макромолекул (ДНК, РНКили белка), разделённых с помощью гель электрофореза, на твёрдую подложку — нитроцеллюлозную мембрану.

Болезнь Гентингтона (Хантингтона) — генетическое заболевание нервной системы, характеризующееся постепенным началом обычно в возрасте 30-50 лет и сочетанием прогрессирующего гиперкинеза хореического и психических расстройств. Нейроморфологическая картина характеризуется атрофией полосатого тела, а на поздней стадии — коры головного.

Гаплотип — комбинация аллелей разных локусов на одной хромосоме.

Гемофилия — наследственное заболевание, связанное с нарушением коагуляции (образования тромба); при этом заболевании возникают кровоизлияния в суставы, мышцы и внутренние органы, как спонтанные, так и в результате травмы или хирургического вмешательства. При гемофилии резко возрастает опасность гибели пациента от кровоизлияния в мозг и другие жизненно важные органы, даже при незначительной травме.

Ген — единица наследственности, занимающая специфическое место (локус) вДНК, кодирующая РНК и способная к самовоспроизведению в клеточном цикле.

Генетическая предрасположенность — специфическая совокупность аллелей, разных генов, формирующих фенотип с относительно высоким риском развития того или иного заболевания.