14. Спорообразование у бактерий. Стадии, функциональное значение.

Споры – своебразная форма покоящихся фирмикутных бактерий, т. е. бактерий с грамположительным типом строения клеточной стенки. Споры образуются при неблагоприятных условиях существования бактерий (высушивание, дефицит питательных веществ и др. Внутри бактериальной клетки образуется одна спора (эндоспора). Образование спор способствует сохранению вида и не является способом размножения, как у грибов. Спорообразующие бактерии рода Bacillus имеют споры, не превышающие диаметр клетки. Бактерии, у которых размер споры превышает диаметр клетки, называются клостридиями, например, бактерии рода Clostridium (лат. Clostridium – веретено). Споры кислотоустойчивы, поэтому окрашиваются по методу Ауески или по методу Циля-Нильсена в красный, а вегетативная клетка в синий цвет.

Процесс образования спор проходит ряд последовательных стадий:

подготовительная. Изменяется метаболизм, завершаетется репликация ДНК и происходит ее конденсация. Клетка содер­жит два или более нуклеоида, один из них локализуется в спорогенной зоне, остальные — в цитоплазме спорангия. Одно­временно синтезируется дипиколиновая кислота;

стадия предспоры. Со стороны цитоплазматической мем­браны вегетативной клетки происходит врастание двойной мембраны, или септы, отделяющей нуклеоид с участком уплот­ненной цитоплазмы (спорогенная зона). В результате чего образуется проспора, окруженная двумя мембранами;

образование оболочек. Вначале между мембранами про-споры образуется зачаточный пептидогликановый слой, затем над ним откладывается толстый пептидогликановый слой кор-текса и вокруг его наружной мембраны формируется споро­вая оболочка;

созревание споры. Заканчивается образование всех струк­тур споры, она становится термоустойчивой, приобретает ха­рактерную форму и занимает определенное положение в клетке.

15. Сложные методы окраски. Окраска по Граму, её этапы.

Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическом составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др. Это позволяет выявиться стркутуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.

Окраска по Граму.

1. На фиксированный мазок на препарат нанести карболово-спиртовый раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1-2 мин ее снять, а краситель смыть.

2. Нанести раствор люголя на 1-2 мин

3. Обесцветить этиловым спиртом в течении 30-6- с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Промыть водой.

5. Докрасить водным раствором фуксина 1-2 мин, промыть, высушить и микроскопировать. Грам +: темно-фиолетовый цвет. Грам -:красные

16. Окраска по Цилю-Нильсену и ее этапы.

Метод окраски по Цилю — Нельсену — метод окраски микроорганизмов для выявления кислотоустойчивых микобактерий (возбудителей туберкулёза, микобактериозов, лепры), актиномицетов и других кислотоустойчивых микроорганизмов. Кислотоустойчивость микроорганизмов обусловлена наличием в их клетках липидов, воска и оксикислот. Такие микроорганизмы плохо окрашиваются разведёнными растворами красителей. Для облегчения проникновения красителя в клетки микроорганизмов нанесённый на препарат карболовый фуксин Циля подогревают над пламенем горелки. Окрашенные микроорганизмы не обесцвечиваются слабыми растворами минеральных кислот и спирта.

1. Фиксированный на пламени горелки мазок окрашивают в течение 3 – 5 мин. раствором карболового фуксина Циля или окрашенной фуксином бумажкой с подогреванием до появления паров, но не доводя краситель до кипения.

2. Дают препарату остыть, бумажку снимают, сливают избыток красителя, препарат промывают водой.

3. Окрашенный препарат обесцвечивают 5%-ным раствором серной кислоты в течение 3 – 5 с или 96° этиловым спиртом, содержащим 3% по объему хлористоводородной кислоты, несколько раз погружая стекло с мазком в стаканчик с солянокислым спиртом.

4. После обесцвечивания остаток кислоты сливают и тщательно промывают препарат водой.

5. Докрашивают дополнительно метиленовым синим Леффлера 3 – 5 мин.

6. Окрашенный препарат промывают водой, подсушивают и микроскопируют.

При окраске препаратов кислоустойчивые бактерии окрашиваются фуксином в рубиново-красный цвет и не обесцвечиваются кислотой.

Некислотоустойчивые бактерии, а также элементы ткани и лейкоциты под действием кислоты обесцвечиваются и приобретают цвет дополнительного красителя.