1 ЛЕКЦИЯ

9

Л Е К Ц И Я №1. ВВОДНАЯ.

СЛ.1. Среди многообразных физических методов, используемых для исследова­ния строения вещества большое применение находят спектральные ме­тоды: ИК-, УФ-, ЯМР-спектроскопия, масс-спектрометрия, рентгеноструктурный анализ.

Спектральные методы исследования широко применяются в клинических, биохимических, санитарно-гигиенических, судебно-медицинских и фармацевтических лабораториях для качественного и количественного анализа объектов биологического происхождения (сыворотка крови, спинномозговая жидкость, моча и др.), лекарственных средств, продуктов питания и т. д.

СЛ.2. Основной целью изучения дисциплины является ознакомление с теоретическими основами спектральных методов и выработке навыков их практического использования для идентификации органических соединений.

СЛ.3. Содержание дисциплины представлено в форме таблицы.

Для получения зачета по элективному курсу необходимо выполнить следующие требования:

1. 94 % (и более) посещаемость теоретического курса (1 пропуск допускается без отработки). 2. Успешное выполнение (70б. и выше) 4 тестовых (по 5 изучаемым спектральным методам) и 1 зачетной контрольных работ.

Ну а теперь перейдем к рассмотрению ОСНОВНЫХ ПОЛОЖЕНИЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ.

СЛ.4. На данном вы видите выдержки из 12 статьи ГФ, утвержденной Минздравсоцразвития РФ в 2007 г. (ОФС 42-0042-07 = официальная фармакопейная статья). Спектроскопические методы анализа являются одними из основных методов анализа лекарственных веществ и их препаратов, включенных в современную фармакопею. Знания по современным спектральным методам используются фармацевтами при подтверждении подлинности ЛС и при тестировании качества фармакопейных препаратов.

СЛ.5. Ксерокопия действующей датированной 1997 г. ФС по одному из использующихся в медицине ЛС – гризеофульвину. Подлинность ЛС доказывается сравнением его ИК- и УФ-спектров со спектрами стандартного образца.

СЛ.6. Современная органическая химия использует широкий набор методов исследования и идентификации веществ, которые можно разделить на 3 группы.

Химические методы установления строения органических соединений сохранили свое значение до настоящего времени. С их помощью, используя качественные реакции, обнаруживают функциональные группы и выясняют строение углеродного скелета: так, двойную связь обнаруживают по реакции обесцвечивания бромной воды, альдегидную группу – по способности восстанавливать аммиачный раствор гидроксида серебра (реактив Толленса) и т.д. Однако использование химических методов связано с большой затратой времени и вещества.

Под физическими методами понимают методы, разработанные физиками и используемые в химии. Информация, получаемая посредством любого физического метода, содержит в себе сведения о тех или иных свойствах вещества в «закодированном» виде. Это может быть спектр, рентгенограмма, хроматограмма и др. Основная задача - уметь «прочитать» эту информацию и квалифицированно использовать ее в своей деятельности.

Физико-химические методы анализа являются компиляцией двух предыдущих.

Установление подлинности вещества по ИК-,УФ-и ЯМР-спектрам является ценным дополнением к химическим и физико-химическим методам фармакопейного анализа.

Физические методы исследования отличаются тем, что в процессе измерения молекулы исследуемых веществ остаются химически неизменными.

СЛ.7. Физические методы исследования можно разделить на 3 группы: спектроскопические, дифракционные и ионизационные методы. В спектроскопических методах исследуется зависимость интенсивности излучения, прошедшего через вещество или рассеянного веществом, от длины волны или частоты падающего излучения. Дифракционные методы измеряют зависимость интенсивности рассеянного излучения от угла рассеяния. Ионизационные методы отличаются от предыдущих тем, что в результате взаимодействия какого-либо падающего излучения или потока частиц с объектом, молекулы последнего ионизируются и из них формируется новый поток частиц, который направляется на анализ.

Следует отметить, что возможности каждого физического метода ограничены – не существует универсального физического метода, который мог бы решить любую структурно-идентификационную задачу без привлечения других данных.

Итак, в процессе изучения данного курса вы получите представление о 5 различных спектральных методах, наиболее часто используемых для получения спектров органических соединений. В ознакомительных целях на следующих слайдах вы увидите, как выглядят эти пять спектров.

СЛ.8. В научный обиход термин спектр (лат. spectrum «виде́ние») в 1671 г. ввёл Ньютон  для обозначения многоцветной полосы, которая получается при прохождении солнечного луча через треугольную стеклянную призму.

Спектр  - это распределение значений  физической величины (обычно энергии, частоты или массы). Спектры можно классифицировать на 4 вида. В рамках нашего курса мы будем рассматривать исключительно спектры поглощения.

СЛ.9. Характерные признаки физического метода: 1) осуществляется взаимодействие падающего излучения, потока частиц или какого-либо поля с объектом; 2) измеряется результат этого взаимодействия.

Для наблюдения спектров поглощения при любых длинах волн необходи­мы следующие основные элементы:

1) источник света (излучения);

2) кювета с образцом,

3) приспособление, позволяющее выделять монохроматическое излучение;

4) приемник, с помощью которого измеряется интенсивность излучения, про­шедшего через образец;

5) регистрирующее устройство.

В общем случае спектр поглощения получают так: 1) выбирается источник излучения 2) излучение подается на монохроматор, с помощью которого можно регулировать длину волны 3) монохроматический луч пропускают через вещество, постепенно изменяя длину волны излучения 4) интенсивность луча, прошедшего через вещество, измеряется приемником и одновременно сравнивается с интенсивностью луча, не прошедшего через вещество.

Таким образом, если луч с веществом не прореагировал, прибор не зафиксирует изменений (пишется прямая линия), а при той длине волны, где произойдет поглощение – прибор зафиксирует изменение интенсивности (всплеск или провал в зависимости от вида спектра).

СЛ.10. При определённой величине энергии воздействия вещество способно перейти в возбуждённое состояние. Возбуждённым состоянием молекулы называется новое энергетическое состояние, которое расположено выше на энергетической шкале, оно является менее стабильным, чем основное состояние (так называется состояние молекулы до сообщения ей дополнительной энергии).

Для спектров поглощения энергия конечного состояния выше энергии начального состояния (Ек > Ен). 

На рисунке представлена схема энергетических уровней 2-хатомной молекулы. Е₀ и Е' – электронные энергетические уровни, соответствующие основному и первому возбужденному электронному состоянию. Каждый электронный уровень имеет набор колебательных и вращательных уровней (спиновые уровни не показаны).

Молекула имеет квантованные энергетические уровни, ее энергия состоит из энергий электронного, колебательного, вращательного и спинового состояний. Теория и эксперимент показывают, что электронная Е значительно > колеб-й, колеб-я Е > вращ-ой, а вращ-я Е > спиновой. В связи с этим, один вид движения в молекуле может изменяться, не затрагивая другие виды движения.

Единственный способ изменить внутримолекулярное движение – это сообщить молекуле определенное кол-во энергии. Поглощение излучения вызывает изменение в энергии электронных, колебательных, вращательных или спиновых уровней, в результате чего возникают УФ-, ИК- и ЯМР-спектры.

Электронные, колебательные и вращательные уровни возбуждаются электрической компонентой излучения, а спиновые уровни - его магнитной компонентой.

СЛ.11. Электромагнитное излучение может быть охарактеризовано либо волно­выми, либо энергетическими параметрами.

Волновой параметр может быть вы­ражен длиной волны (ИК- и УФ-спектры) – показать на ось х – там длина волны в УФ-спектре или волновое число – величина, обратная длине волны в ИК-спектре или частотой колебания (ЯМР-спектр) показать на ось х: м.д. - это миллионные доли поля – параметр, зависящий от резонансной частоты поглощенного излучения.

В масс-спектральном анализе (обратите внимание, что этот спектральный метод называется не масс-спектроскопия, а масс-спектрометрия). Поэтому на оси х откладывается не волновой параметр, а отношение массы к заряду m/z . Этот спектральный метод дает возможность определить молярную массу вещества.

Энергетический параметр определяется энергией перехода между двумя энергетическими уровнями. Оба параметра связаны между собой уравнением, называющимся соотношение Планка.

По оси у в ИК- и УФ-спектрах откладывается интенсивность поглощенного излучения.

СЛ.12. На этом слайде приведены 4 примера спектров поглощения.

Показать волновой параметр на разных спектрах.

Спектр можно получить, воздействуя на вещество световым потоком (электромагнитной энергией) с определённой длиной волны (так получают ИК- и УФ-спектры), магнитным полем (ЯМР-спектр), потоком электронов (масс-спектр) и другими способами.

Любой спектр состоит из множества полос. Каждая спектральная полоса характеризуется положением максимума, интенсивностью поглощения и формой линии поглощения.

СЛ.13. На данном слайде приведен рентгеновский спектр для синтезированного нашей научной группой БАС из класса монотерпенов.

СЛ.14. Электромагнитные волны окружают нас повсеместно. Они везде. С их помощью мы слушаем радио, смотрим телевизор, общаемся по мобильному телефону. Без всего этого наша жизнь была бы не просто другой, намного более тяжелой или неудобной, наша жизнь была бы просто невозможной! Свет – это тоже электромагнитные волны. С помощью электромагнитных волн у нас есть возможность видеть окружающие нас предметы. 

Электромагнитный спектр (спектр ЭМИ) простирается от у-лучей с длиной волны 10^-10 см до радиоволн с длиной волны порядка >10⁵ см. Таким образом, длины волн по электромагнитному спектру из­меняются на 15 порядков. Энергия по спектру также отличается от 10²¹ эВ и более для жестких лучей до 10⁷ эВ для радиоволн, т.е. энергия излучения изменяется на 14 порядков.

К настоящему времени разработано уже несколько десятков различных спектральных методов анализа. Каждый из аналитических методов обычно использует не полный спектр вещества, охватывающий диапазон длин волн от рентгеновских излучений до радиоволн, а только определённую его часть.

Спектральные методы обычно различаются по диапазону длин волн спектра, являющемуся рабочим для данного метода: на ультрафиолетовых волнах работает УФ спектроскопия, инфракрасные волны используются в ИК спектроскопии, радиочастотное излучение - в ЯМР спектроскопии, рентгеновское – в РСА.

Согласно соотношению Планка, чем меньше длина волны излучения, тем больше его энергия. Поэтому самым энергоемким является возбуждение электронов (спектр РСА), а меньше всего энергии расходуется на возбуждение ядерного спина (ЯМР спектр).

СЛ.15. В таблице отражен результат взаимодействия электромагнитного излучения с веществом в разных областях электромагнитного спектра.

СЛ.14. На данном слайде приведены характеристики различных методов спектрального анализа и информация о веществе, которую с их помощью можно получить.

Как не существует универсального физического источника излучения, позволяющего генерировать электромагнитное излучение любой энергии внутри одного прибора, так не существует и вещества, реагирующего со всеми видами излучения по всему спектру. Иными словами, составные части молекулы (электроны, ядра, атомы, группы атомов) избирательно взаимодействуют с излучением.

Так, рентгеновские лучи претерпевают дифракцию на атомах кристаллов, УФ и видимые лучи ЭМС поглощаются валентными электронами молекул, к ИК излучению чувствительны группы атомов, объединенные в функциональные группы, радиочастотное излучение вызывает изменение энергетического состояния ядер атомов в молекулах.

Методы, работающие в УФ, видимом и ИК диапазоне, называют оптическими.

А полная геометрическая структура молекулы – по спектру РСА.

СЛ.15. Поглощением света (электромагнитного излучения) называется явление уменьшения энергии световой волны при её распространении в веществе, которое происходит вследствие преобразования энергии волны во внутреннюю энергию вещества или в энергию вторичного излучения, имеющего другой спектральный состав и иные направления распространения.

Поглощение излучения описывается законом Бугера - Ламберта - Бера. Этот  физический закон количественно описывает зависимость между оптической плотностью и концентрацией в-ва.

Поглощение монохроматического электромагнитного излучения описывается следующей формулой: D = lg I₀/I = ε X c X l, где D – оптическая плотность; I₀ – интенсивность падающего света; I – интенсивность прошедшего света; с – молярная концентрация вещества, моль/л; l – длина пути света, см; ε – молярный коэффициент экстинкции (поглощения), л/мольxсм.

По закону Бугера-Ламберта-Бера интенсивность монохроматического излучения уменьшается экспоненциально по мере прохождения через поглощающую среду.

Основной закон поглощения излучения справедлив для всех областей ЭМ спектра.

СЛ.16. Но́белевская пре́мия — одна из наиболее престижных международных премий, ежегодно присуждаемая за выдающиеся  научные исследования. Размер Нобелевской премии (на 2012 г.) составляет 1,1 млн. долларов. 

На Нобелевских медалях по физике и химии изображена богиня Природы, появляющаяся из облаков, которая держит в руке Рог Изобилия. Сбоку стоит Гений Науки и приоткрывает шаль, которой покрыта голова богини Природы. Надпись на медалях гласит: "Inventas vitam juvat excoluisse per artes" = "Изобретение делает жизнь лучше, а искусство - прекраснее".

Признанием важнейшей роли физических методов в химии является то, что по правилам ИЮПАК (International Union of Pure and Applied Chemistry) структура новых соединений должна быть подтверждена методами масс-спектрометрии, ЯМР-, ИК-спектроскопии и других физических методов.

СЛ.6. К несомненным достоинствам физических методов относятся:

• простота пробоподготовки и  качественного анализа проб

• большая универсальность (возможность анализа многокомпонентных смесей)

• широкий динамический диапазон (возможность определения основных, примесных и следовых количеств веществ)

• низкие пределы обнаружения как по концентрации  (до 10^-8 % без использования концентрирования, так и по массе (10^-10 -10^-20 г), что позволяет расходовать предельно малые количества пробы, а иногда проводить неразрушающий анализ.

Многие физические методы исследования позволяют выполнять анализ с пространственным разрешением вплоть до моноатомного уровня. 

СЛ.9. Характерными признаками физического метода являются: 1) осуществляется взаимодействие падающего излучения, потока частиц или какого-либо поля с объектом; 2) измеряется результат этого взаимодействия.

В общем случае спектр поглощения получают так: 1) выбирается источник излучения 2) излучение подается на монохроматор, с помощью которого можно регулировать длину волны 3) монохроматический луч пропускают через вещество, постепенно изменяя длину волны излучения 4) интенсивность луча, прошедшего через вещество, измеряется приемником и одновременно сравнивается с интенсивностью луча, не прошедшего через вещество. Таким образом, если луч с веществом не прореагировал, прибор не зафиксирует изменений (пишется прямая линия), а при той длине волны, где произойдет поглощение – прибор зафиксирует изменение интенсивности (всплеск или провал в зависимости от вида спектра).

СЛ.7. Физические методы исследования можно разделить на 3 группы: спектроскопические, дифракционные и ионизационные методы. В спектроскопических методах исследуется зависимость интенсивности излучения, прошедшего через вещество или рассеянного веществом, от длины волны или частоты падающего излучения. Дифракционные методы измеряют зависимость интенсивности рассеянного излучения от угла рассеяния. Ионизационные методы отличаются от предыдущих тем, что в результате взаимодействия какого-либо падающего излучения или потока частиц с объектом, молекулы последнего ионизируются и из них формируется новый поток частиц, который направляется на анализ.

По сравнению с другими физическими методами, спектральные методы исследования отличает простота интерпретации и хорошая воспроизводимость результатов.

Однако следует отметить, что возможности каждого физического метода ограничены – не существует универсального физического метода, который мог бы решить любую структурно-идентификационную задачу без привлечения других данных.

СЛ.9. В таблице приведены характеристики различных методов спектрального анализа и информация о веществе, которую с их помощью можно получить.

1) Как не существует универсального физического источника излучения, позволяющего генерировать электромагнитное излучение любой энергии внутри одного прибора, так не существует и вещества, реагирующего со всеми видами излучения по всему спектру. Иными словами, составные части молекулы (электроны, ядра, атомы, группы атомов) избирательно взаимодействуют с излучением.

Так, рентгеновские лучи претерпевают дифракцию на атомах кристаллов, УФ и видимые лучи поглощаются валентными электронами молекул, к ИК излучению чувствительны группы атомов, объединенные в функциональные группы, радиочастотное излучение вызывает изменение энергетического состояния ядер атомов в молекулах.

2)

Ограничения каждого метода обусловлены как строением молекул исследуемого соединения, набором его физических и химических свойств, так и природой физического явления, лежащего в основе используемого метода. Так, если рентгеноструктурный анализ (РСА) не позволил определить координаты легких атомов водорода, то метод ЯМР-спектроскопии дополняет картину химического строения вещества.

СЛ.10. В таблице отражен результат взаимодействия электромагнитного излучения с веществом в разных областях электромагнитного спектра.

СЛ.11. Шкала электромагнитного излучения наглядно иллюстрирует представленные в таблице предыдущего слайда цифры.

Самой важной характеристикой излучения является энергия, которая характеризуется длиной волны и частотой. Согласно соотношению Бора, чем меньше длина волны излучения – тем больше его частота и энергия. Поэтому самым энергоемким является возбуждение электронов, а меньше всего энергии расходуется на возбуждение ядерного спина.

СЛ.12. При поглощении энергии молекула переходит в новое энергетическое состояние, которое расположено выше на энергетической шкале и поэтому является менее стабильным. Такое состояние называется возбужденным, а состояние м-лы до сообщения ей дополнительной энергии – основным.

На рис. представлена схема энергетических уровней 2-хатомной молекулы. Е₀ и Е' – электронные энергетические уровни, соответствующие основному и первому возбужденному электронному состоянию. Каждый электронный уровень имеет набор колебательных и вращательных уровней (спиновые уровни не показаны).

Молекулу можно представить как взаимосвязанную систему ядер и электронов, внутри которой происходят постоянные движения, не изменяющие принципиальной молекулярной картины, т.е. положения атомов друг относительно друга. Молекула имеет квантованные энергетические уровни, и ее энергия состоит из энергий электронного, колебательного, вращательного и спинового состояний. И теория, и эксперимент показывают, что электронная Е значительно > колеб-й, колеб-я Е > вращ-ой, а вращ-я Е > спиновой. В связи с этим, один вид движения в молекуле может изменяться, не затрагивая другие виды движения.

Единственный способ изменить внутримолекулярное движение – это сообщить молекуле определенное кол-во энергии. Поглощение излучения вызывает изменение в энергии электронных, колебательных, вращательных и спиновых состояний, в результате чего возникают УФ-, ИК- и ЯМР-спектры.

Электронные, колебательные и вращательные уровни возбуждаются электрической компонентой излучения, а спиновые уровни - его магнитной компонентой.

СЛ.13. Поглощением света (электромагнитного излучения) называется явление уменьшения энергии световой волны при её распространении в веществе, происходящее вследствие преобразования энергии волны во внутреннюю энергию вещества или в энергию вторичного излучения, имеющего другой спектральный состав и иные направления распространения.

Для оптических спектров имеются общие законы поглощения излучения. Объединённый закон Бугера-Ламберта-Бера количественно описывает зависимость между оптической плотностью и концентрацией в-ва. Поглощение монохроматического электромагнитного излучения описывается следующей формулой: D = lg I₀/I = ε X c X l, где D – оптическая плотность; I₀ – интенсивность падающего света; I – интенсивность прошедшего света; с – молярная концентрация вещества, моль/л; l – длина пути света, см; ε – молярный коэффициент экстинкции (поглощения), л/мольxсм.

По закону Бугера-Ламберта-Бера интенсивность монохроматического излучения уменьшается экспоненциально по мере прохождения через поглощающую среду.

Количественный анализ содержания действующих компонентов в составе лекарственной формы является одной из основных задач и процессе контроля качества лекарственных препаратов. Закон Бугера-Ламберта-Бера используется в ГФ для количественного анализа ЛС в УФ- и ИК-области. Эта задача заключается в определении концентрации анализируемого вещества на основе закона Бугера—Ламберта —Бера по измеренной оптической плотности раствора при определенной аналитической длине волны, для которой известен молярный коэффициент поглощения. Расчет концентрации вещества производят по формуле С= D/(εl).

Спектрофотометрический анализ используется для оценки примесей в лекарственных веществах, определения лекарственных веществ и их метаболитов в биологических жидкостях при исследовании фармакокинетики и метаболизма.

СЛ.14. Спектральные данные записываются как зависимость коэффициента поглощения от длины волны, т.е. выражаются с помощью двух переменных величин – интенсивности (при записи спектра интенсивность откладывается на оси ординат) и длины волны (длина волны откладывается на оси абсцисс).

В ИК области запись спектра осуществляется в % пропускания или в % поглощения, а в УФ области преимущественно используется молярный коэффициент экстинкции или его десятичный логарифм, так как интенсивность поглощения в УФ области для одного вещества может изменяться на несколько порядков.

Длина волны м.б. выражена либо в нанометрах (УФ область спектра), либо в обратных см (ИК область).

В см^-1 измеряется волновое число, которое = величине, обратной длине волны, измеренной в сантиметрах, т.е. числу волн, укладывающихся в 1 см.

СЛ.15. На слайде приведены примеры электронного и ИК спектров. Любой спектр состоит из множества полос. Спектр сложных молекул обычно имеет несколько полос поглощения, каждая из которых характеризуется положением максимума, интенсивностью поглощения и формой линии поглощения.

Показать на примере одной из полос ИК спектра: полоса с перегибом (плечом) обязана перекрыванию двух близкорасположенных полос.

На примере УФ спектра: в спектрах некоторых соединений проявляется тонкая структура полосы. Она обязана колебательным переходам и поэтому называется колебательной структурой полосы.