63. Реакции иммунного лизиса. Реакция связывания комплемента: ингредиенты, механизм, практическое применение.

Реакция иммунного лизиса. В ходе реакции иммунного лизиса антитела образуют иммунные комплексы с поверхностными антигенами клетки (эритроцита в реакции гемолиза или бактерии в реакции бактериолиза), что приводит к активации на поверхности клетки комплемента и её комплементзависимому лизису. Реакция гемолиза. Реакция гемолиза используется для определения титра и активности комплемента, а также как индикатор для оценки РСК; реакция локального гемолиза в геле носит название реакции Ерне. Реакция Ерне. Используется для определения числа антителообразующих клеток в лимфоидных органах; в гель вносятся эритроциты, суспензия клеток исследуемой лимфоидной ткани и комплемент – число образующихся в результате реакции зон гемолиза равно числу клеток, секретирующих гемолизины.

Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), те происходит связывание комплемента комплексом антиген - антитело. Если же комплекс антиген - антитело не образуется, то комплемент остается свободным.

РСК проводят в две фазы 1 -я фаза - инкубация смеси, содержащей антиген + антитело + комплемент, 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген - антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная). Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция отрицательная).

64. Реакции твёрдофазного иммунологического анализа. Реакция иммунофлюоресценции, варианты. Иммуноферментный анализ: ингредиенты, механизмы. Иммуноблоттинг. Радиоиммунный анализ. Иммунная электронная микроскопия. Практическое применение РИФ, ИФА, РИА, ИЭМ.

Реакция иммунофлюоресценции - РИФ. Различают три разновидности метода прямой, непрямой, с комплементом. Является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител.

Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФИ люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью

антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела +антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном

микроскопе, как и при прямом методе.

Популярность РИФ объясняется экономичностью, наличием широкого спектра диагностических наборов, быстротой получения ответа. Основным недостатком РИФ является ее субъективность.

Радиоиммунный анализ (РИА) - высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген - антитело с применением антигенов или антител, меченных радионуклидом (125J, 14С, ЗН, 51Сг и др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике (бета- или гамма-излучение). Интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.

Иммуиоферментный анализ (ИФА) - выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазной и или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченой ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции - интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. Твердофазный ИФА - вариант теста, когда один из компонентов иммунной - реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или антигенов. При положительном результате изменяется цвет хромогена.

Достоинства ИФА: высокая чувствительность, позволяющая выявлять концентрации антигена до 10 пг/мл; высокая стандартность и воспроизводимость; возможность использовать минимальные объемы исследуемого материала; стабильность при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более); простота проведения реакции; наличие как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета; возможность автоматизации всех этапов реакции; относительно низкая стоимость диагностических наборов и оборудования.

Применение ИФА: диагностика инфекционных заболеваний: обнаружение антигенов возбудителя; обнаружение антител к антигенам возбудителя; мониторинг заболевания, определение ответа на терапию, прогноза развития заболевания и его исхода; контроль поствакцинального иммунитета; диагностика аутоиммунных заболеваний: определение аутоантител; диагностика аллергических заболеваний: определение общего и специфического IgE; определение продуктов активированных эозинофилов, базофилов и тучных клеток; диагностика злокачественных опухолей: определение в сыворотке маркеров опухолевого роста; фенотипирование опухолевых клеток (тканей) для уточнения происхождения и дифференцировки опухоли; определение концентрации гормонов, параметров менструально-овуляторного цикла; диагностика беременности; определение концентрации лекарственных препаратов; определение допинга; определение загрязнения окружающей среды.

Иммуноблоттинг – метод, позволяющий одновременно выявлять специфические антитела к спектру антигенов (к каждому из них) в сыворотке или другом материале. ИБ основан на тИФА; в отличие от тИФА в планшетах обладает большей специфичностью, но меньшей чувствительностью.

Этапы постановки ИБ:

1. Подготовка антигенов: лизис/дезинтеграция вирусов, бактерий; обработка додецил сульфатом натрия для придания всем компонентам схожего соотношения отрицательный заряд/молекулярная масса.

2. Получение блотов: разгонка антигенов в электрофорезе (пропорционально размеру);

перенос антигенов на мембрану;

разрезание мембраны на блоты (полоски, содержащие спектр антигенов) .

3. Проведение реакции: обработка блота сывороткой больного (специфические антитела больного связываются с соответствующими антигенами);выявление связавшихся антител антивидовыми антителами к иммуноглобулинам человека, меченными ферментом;

внесение субстрата и проявление блотов (при связывании специфических антител в месте связывания образуется пятно);

4. Учет реакции (сравнение результата с положительным и отрицательным контролями) и выдача заключения.

ИБ применяют для: подтверждения результатов других серологических реакций; идентификации бактериальных или вирусных белков; идентификации микробов; научных целей.

Иммунная электронная микроскопия - электронная микроскопия микробов, чаще вирусов, обработанных соответствующими антителами. Вирусы, обработанные иммунной сывороткой, образуют иммунные агрегаты (микропреципитаты). Вокруг вирионов образуется "венцы" из антител, контрастированный фосфорно-вольфрамовой кислотой или другими электроннооптически плотными препаратами.

65. Т-лимфоциты: развитие, маркёры, субпопуляции. Т-хелперы первого и второго типов, спектр продуцируемых цитокинов. Контроль иммунного ответа Т-лимфоцитами (Th3, T-регуляторы, CD4+CD25+). Методы определения количества и функциональной активности Т-лимфоцитов.

Т-лимфоциты представляют популяцию лимфоцитов, предшественники которых образуются в ККМ и затем мигрируют для дальнейшего созревания и дифференцировки в тимус.

Развитие:

1. Костный мозг. Образование Т-лимфоцитов (клетки экспрессируют CD34+-рецептор).

2. Выход в кровоток и движение в тимус (т.к. на поверхности имеются адресные молекулы к эндотелию сосудов коры тимуса).

3. Тимус (созревание и дифференцировка Т-лимфоцитов).

1) Тимические предшественники - наименее дифференцированные лимфоидные клетки тимуса (еще очень похожи на СКК). Экспрессируют: CD44 (рецептор хоминга в тимус), CD117 (рецептор СКК), IL-7R (рецептор выживания и размножения тимоцитов).

2) Ранние Т-лимфоциты. Начинает формироваться ТКР: происходит транскрипция β-цепи и перестройка γ-цепи. Являются дважды отрицательными клетками, поскольку не несут антигенов CD4 и CD8. Живут около 3 дней и только 30% их продолжает развитие.

3) Общие Т-лимфоциты. Экспрессия а-,β,γ-цепей TКР. Являются дважды положительными клетками (имеют антигены CD4 и CD8 ).

4) Зрелые Т-лимфоциты. Образуется две популяции единожды положительных клеток – одна популяция несет антиген CD4, другая - CD8.

Процесс «обучения» Т-лимфоцитов в тимусе:

«Положительная» селекция - «поддержка» клонов Т-лимфоцитов, рецепторы которых могут эффективно связываться с молекулами ГКГС на эпителиальных клетках коркового слоя тимуса. Такие клетки получают сигнал на выживание и размножение (ростовые факторы тимуса), остальные клетки погибают.

«Отрицательная» селекция - «выбраковка» аутореактивных клонов Т-лимфоцитов дендритными клетками в пограничной, корково-мозговой зоне тимуса. Клетки, реагирующие с “собственными” антигенами, уничтожаются путем апоптоза.

Итог: Более 99 % Т-лимфоцитов не выдерживают испытаний и погибают. Менее 1 % клеток превращается в зрелые формы, способные распознать в комплексе с ГКГС только чужеродные биополимеры.

4. Выход в кровоток и лимфатическую систему зрелых Т-лимфоцитов (дальнейшая дифференцировка).

Субпопуляции Т-лимфоцитов:

1. CD4+-клетки, рестриктированные по МНС II :

Т-хелперы. Выделяют Тх0, Тх1 и Тх2. Мишени: В- и Т-лимфоциты. Функция: секреция цитокинов.

Т-индукторы. Функция - взаимодействие с Тх, Тс, Тц, Мф, в отличие от Т-хелперов, которые взаимодействуют преимущественно с В-лимф. Функция: секреция цитокинов.

Т-эффекторы ГЗТ. Мишени: Мф, Тц, кл.Лангерганса. Функция - локализация инфекции.

2. CD8+-клетки,рестриктированные по МНС-I:

Т-цитотоксические лимфоциты. Это клетки-киллеры. Функция - уничтожение клеток, инфицированных вирусом, опухолевых клеток, и т.д.

Т-супрессоры. Функция - угнетение пролиферации других типов клеток.

3. CD4+ и CD8+-клетки,рестриктированные по МНС-I и МНС II:

Клетки-памяти. Маркер – CD4, CD8. Мишени: В- и Т-лимфоциты. Могут выживать в организме до 40 лет и более. Однако эффективный ответ на АГ сохраняется до10-15 лет.

Т- хелперы 1 типа. Индуцирующие антигены - АГ внутриклеточных МО (микобактерии, листерии, вирусы). АПК - дендритные клетки, макрофаги. Образуемые цитокины: ИЛ-2, ИЛ-12, ИФ-γ, ФНО. Формируемые реакции: клеточные реакции, противовирусный иммунитет, аутоиммунные реакции.

Т-хелперы 2 типа. Индуцирующие антигены - аллергены, АГ гельминтов, белковые антигены. АПК - В-лимфоциты, макрофаги, дендритные клетки. Образуемые цитокины: ИЛ- 4, 5, 6, 10, 13. Формируемые реакции: гуморальный иммунитет, аллергические реакции, иммунитет против паразитов.

Антигенные маркеры:

1. Молекулы контактного взаимодействия:

а) Адгезия: важна для выхода Т-лимфоцитов в ткани и удержания Т-клетки в контакте с АПК. CD2 - CD58;

б) Ко-стимуляция: необходима для получения Т-клеткой второго сигнала, без которого активация является неполной, а Т-клетка погибает от апоптоза. CD2; CD40 - CD40L; CD5 - CD72; CD24; CD28, CD80, CD86.

2. Корецепторы CD4, CD8: обеспечивают рестрикцию распознавания, усиливают сигнал о связывании антигена, маркеры функции лимфоцита.

Методы определения количества и функциональной активности Т-лимфоцитов.

1. определение Е-розеток основано на наличии на мембране Т-лимфорецепторов к эритроцитам барана. При смешивании лимфоцитов крови человека и эритроцитов барана образуются "розетки" - лимфоцит с прилипшими к нему 3 и более эритроцитами.

2. кожно-аллергические пробы с соответствующими антигенами или веществами, имитирующими антигены (фитогемагглютинин), которые названы мутагенами;

3. реакция бластной трансформации лимфоцитов с фитогемагглютинином или соответствующими антигенам проявляется в превращении лимфоцитов в более крупные молодые клетки - бласты, число которых подсчитывается в препарате на 200 лимфоцитов.

4. реакция подавления миграции макрофагов или гранулоцитов под действием фактора, продуцируемого Т-лимфоцитами при взаимодействии со специфическим антигеном. Лимфоциты человека смешивают с предполагаемым антигеном, а через 18 часов в каплю полученной культуральной жидкости опускают капилляр, наполненный подвижными макрофагами или гранулоцитами и через, сутки измеряют степень их миграции из опытного и контрольного (без антигена) капилляров. Их отношение называется индексом подавления миграции.

5. определение цитотоксичности Т-киллеров выявляется при взаимодействии лимфоцитов больного с клетками-мишенями, т.е. клетками, выдавшими их образование. Подсчитывается количество погибших клеток.

66. Т-клеточный рецептор: строение, типы, генетический контроль, разнообразие. Т-зависимые антигены. Т-клеточные эпитопы. Т-клеточная рестрикция. Активация Т-лимфоцитов. Костимуляция. Модель двух сигналов: ответ, апоптоз, анергия.

ТКР является гетеродимером, и состоит из 2 различных цепей. Обе цепи - трансмембранные белки суперсемейства иммуноглобулинов.

Внеклеточная часть содержит вариабельный (V) и константный (С) домены. Эта часть молекулы отвечает за распознавание и связывание антигена.

Мембранная часть - стабилизирует структуру рецептора при отсутствии АГ.

Клеточная часть рецептора - участвует в проведении сигнала активации к ядру лимфоцита.

Типы ТКР:

• аβ ТКР - около 95% клеток. Эти клетки отвечают за все известные функции лимфоцитов. Они циркулируют в тканях, периферической крови, заселяют лимфоузлы.

• уδ ТКР - около 5% клеток. Эти лимфоциты продуцируют широкий спектр цитокинов, обладают цитотоксичностью, хорошо отвечают на внутриклеточные АГ. Они обнаруживаются в коже и слизистых.

Молекулы ТКР ассоциированы с молекулами CD3 и CD4/CD8.

1. CD3- это комплексная молекула, состоящая как минимум из 5 полипептидных цепей. Она участвует в передаче сигнала о распознавании и связывании антигена.

2. Корецепторы CD4/CD8 тесно связаны с ТКР и распознают свои молекулы ГКГС I и II. Эти рецепторы экспрессируются в соответствии с функцией лимфоцитов (их субпопуляционной принадлежностью) и обеспечивают рестрикцию распознавания Т-лимфоцитов.

Гены ТКР:

Альфа (гамма) цепь - это продукт 3 групп генов (V, J, C). Бета (дельта) цепь дополнительно включает группу генов D, что увеличивает разнообразие ТКР. Гены а- и β -цепей локализованы на хромосоме 14, а гены δ- и у-цепей — на хромосоме 7. ТКР формируется за счет перестройки генов и соматических мутаций в гипервариабельных областях (две такие области кодируются V-генами, одна VJ-генами для альфа цепи и VDJ -генами для бета-цепи). Количество специфичностей ТКР составляет около 1015- 1018.

В-лимфоциты и антитела будут распознавать одни детерминанты, Т-лимфоциты - другие. Это потому, что презентируются не интактные молекулы антигена, а лишь его фрагменты после процессинга в ассоциации с МНС молекулами на клеточной поверхности. Большинство эпитопов, распознаваемых Т-клетками, представляет собой фрагменты пептидной цепи, часто недоступные для иммунного распознавания в составе молекул интактного белка.

Т-зависимые антигены - это антигены, для распознавания которых нужны и Т- и В-клетки.

Т-клеточная рестрикция:

Т-клетки способны связываться с антигеном, только если он представлен на поверхности другой клетки в форме комплекса с молекулой ГКГС. Несмотря на относительно слабый характер этой реакции, она может усиливаться, если молекула ГКГС слегка изменена из-за наличия антигенного пептида в углублении поверхности молекулы ГКГС. Эта молекула подвергается рестрикции, и ТКР взаимодействует как с антигенным пептидом, так и с окружающими петлями молекулы ГКГС.

Рестрикция II класса ГКГС. СD4+Т-клетки распознают малые антигенные пептиды, состоящие из 10—15 амк и связанные с молекулами II класса ГКГС.

Рестрикция I класса ГКГС. СD8+Т-клетки распознают антигенные пептиды, содержащие 9—10 амк, которые образуются из белков, синтезируемых внутри клеток. Например, из вирусных белков в клетке, инфицированной вирусом. Эти эндогенные пептиды проникают в эндоплазматическую сеть. Там они комплексируются с вновь синтезируемыми молекулами I класса ГКГС и транспортируются к плазмолемме для распознавания CD8+ Т-клетками.

Активация Т-лимфоцитов (2-х сигнальная модель)

1. Первый сигнал = связывание ТКР с комплексом олигопептид-ГКГС I или II типа: изменение конформации CD3 комплекса (сближение молекул CD3 и корецепторов (CD4/CD8)); взаимное фосфорилирование по остаткам тирозина; присоединение через белки-адапторы и активация различных киназ, опосредующих активацию транскрипционных факторов, изменение цитоскелета, отмену апоптоза (однако этого недостаточно для активации!).

2. Второй сигнал. Необходимы костимуляторные взаимодействия (взаимодействия костимуляторных молекул). Таким образом активируются 3 транскрипционных фактора, необходимые для активации генов ИЛ2 и его рецептора.

Костимуляторные молекулы необходимы для развития гуморального и клеточного ответа. Их роль заключается в усилении сигнала активации Т-лимфоцитов и отмены срабатывания механизмов апоптоза. Наиболее важные пары: CD28 - CD80/CD86- основные пары для активации Т-лимфоцитов. CD40-CD40L - для активации В-лимфоцита.

3. Дальнейшая активация связана с синтезом и рецепцией ИЛ2. ИЛ2Р работает через Jak1, 3 и Stat 5. После активации Stat 5 образует гомодимер и транспортируется в ядро. В ядре происходит разрушение ингибитора пролиферации и активация циклинов D2 и D3 и их киназ, после чего Т-лимфоцит переходит в S фазу и, далее, в митоз.

4. Если 2 сигнала полноценны, то развивается нормальный ответ. Если один из сигналов отсутствует, или не полноценен, то возможны 2 пути: апоптоз и анергия

Анергия — полная или частичная утрата организмом специфической иммунологической реактивности (обычно в форме ГЗТ). При анергии отмечается отрицательный или сниженный ответ CD4+ Т-лимфоцитов на специфические антигены in vitro и in vivo.

Апоптоз — механизм запрограммированной гибели клетки или группы клеток организма. Сигналы, запускающие механизмы апоптоза, активи­руют ферменты, которые вызывают фрагментацию ДНК на участки 50-300 п.н. и разрушение клетки. После этого начинаются фагоцитоз и элиминация апоптозных телец макрофагами. Признаками апоптоза являются уменьшение размеров клетки, уплотнение и фрагментация хроматина, скопление его возле ядерной мембраны, уменьшение объема цитоплазмы. При этом гибель клеток не сопровождается воспалением и повреждением тканей.