57. Методы определения концентрации иммуноглобулинов: простая радиальная иммунодиффузия по Манчини, ифа.

Реакция радиальной иммунодиффузии. Иммунную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях. Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют для определения в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.

Иммуиоферментный анализ (ИФА) - выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазной и или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченой ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции - интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. Твердофазный ИФА - вариант теста, когда один из компонентов иммунной - реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или антигенов. При положительном результате изменяется цвет хромогена.

Достоинства ИФА: высокая чувствительность, позволяющая выявлять концентрации антигена до 10 пг/мл; высокая стандартность и воспроизводимость; возможность использовать минимальные объемы исследуемого материала; стабильность при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более); простота проведения реакции; наличие как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета; возможность автоматизации всех этапов реакции; относительно низкая стоимость диагностических наборов и оборудования.

58. Контроль биосинтеза иммуноглобулинов. Гены иммуноглобулинов. Механизм

взаимодействия антител с антигенами: специфичность, фазы, проявления. Аффинность и авидность.

Гены иммуноглобулинов

• Имеют фрагментарную организацию. Их сегменты находятся на расстоянии друг от друга.

• Любые клетки содержат весь набор генов, но только у В-Лф эти гены являются актуальными (т.е. реально работающими).

• Легкие и тяжелые цепи кодируются разными генами и разным количеством генов.

• Эти гены расположены в разных хромосомах, V и С домены кодируются отдельно.

• Гены каппа-цепи - во 2-й хромосоме.

• Около 250 V-генов (кодирует 94-95 аминокислот)

• J-генов (joining – соединение) (кодирует 12-14 аминокислот)

• 1 С-ген (кодирует постоянный фрагмент каппа-цепи)

• Число возможных вариантов каппа-цепи: 250 х 5 = 1225

• Гены лямбда-цепи – в 22-й хромосоме.

• 100 V-генов,

• J-генов

• 1 С-ген

• Число возможных вариантов лямбда-цепи: 100 х 6 = 600

• Н-цепи кодируются генами 14 хромосомы.

• V-домены кодируются 3 группами генов (V, D, J):

• 200 V-генов,

• 50 D-генов (diversity)

• J-генов

• С-домены – 5 генов (по типу тяжелых цепей).

• Число возможных вариантов тяжелых цепей: 200х50х5=50000

• Разные варианты тяжелых и легких цепей также соединяются случайно, поэтому число вариантов иммуноглобулинов, связывающих разные антигены достигает 1011-1013.

Естественные АТ - имеются в организме без предварительного введения антигена, естественные АТ против микробов образует популяция В1-лимфоцитов.

Иммунные АТ - появляются после попадания в организм антигенов. Противоинфекционные иммунные АТ образуются как ответ иммунной системы на попадание в организм антигенов микробов, возможно появление антибактериальных, антивирусных, антитоксических и др.

Бивалентные полные антитела (обычно класса IgG) имеют 2 активных центра.

Неполные антитела моновалентны – у них действует только один активный центр из-за пространственной блокировки второго центра

Взаимодействие Ат и Аг

1 фаза – случайное столкновение. Это неспецифическая фаза, легко подается обратному процессу.

2 фаза – специфическая, если Аг и Ат комплементарны. Более сильное взаимодействие на атомарном уровне: электростатические (кулоновские силы), гидрофобные, гидрофильные, межмолекулярные (Ван-дер-Ваальса).

Результат: Образование иммунного комплекса активирует комплемент с последующим лизисом чужеродной клетки (антигена). Иммунный комплекс опсонизирует объект фагоцитоза, тем самым резко активизируя фагоцитарную реакцию, через Fc-фрагмент антитела связывается с Fc-рецепторами клеток организма и вызывает ряд важных иммунобиологических процессов.

Аффиность и авидность – качества, от которых зависит прочность комплекса АГ-АТ.

• Сила связывания 1 активного центра антитела с эпитопом антигена называется аффинностью. Наиболее высока у IgG.

• Прочность связывания всей молекулы иммуноглобулина с антигеном называется авидностью. Увеличивается с возрастанием количества активных центров. Наиболее высока у IgM.

59. Серологический метод исследования: определение, задачи, основные понятия (диагностикум, диагностическая сыворотка, титр, диагностический титр, парные сыворотки). Материал для серологического исследования, оценка метода. Общие закономерности серологических реакций. Использование серологических реакций для определения неинфекционных маркёров.

Серологическим называют метод исследования, в основе которого лежит реакция специфического взаимодействия антигенов и антител. На основе ее специфичности возможно определение неизвестных антител при взаимодействии с известным антигеном или неизвестного антигена по связыванию с известным антителом.

Задачи:

1. Серологическая диагностика инфекционных и иммунных заболеваний, основанная на обнаружении в сыворотке крови больных антител. Обоснованием для постановки диагноза является: а) обнаружение антител к возбудителю болезни или диагностическом титре, т.е. в таком разведении сыворотки, в котором реакция может быть положительна только у больных и отрицательна у здоровых; б) нарастание титра антител при повторном исследовании в динамике болезни, что позволяет отличить заболевание от поствакцинального или постинфекционного иммунитета.

2. Серологическая диагностика инфекционных заболеваний, основанная на обнаружении в биологических жидкостях или тканях антигенов патогенных микробов.

3. Серологическая идентификация неизвестных микробов, выделенных при бактериологическом методе диагностики инфекционных болезней. Обоснованием для отнесения микроба к определенной серогуппе, сероварианту или виду является: а) взаимодействие микроба с адсорбированной моноспецифической сывороткой, содержащей антитела только к специфическим для микроба антигенам (из таких сывороток в процессе их производства сорбируются антитела к групповым антигенам); б) взаимодействие микроба с моноклональными антителами, полученными методом гибридомной техники, т.е. метода культивирования гибрада из плазматической клетки, синтезирующей антитела одной специфичности, с опухолевой клеткой, способной к длительному размножению в культуре; в) взаимодействие микроба с диагностической сывороткой в разведении, составляющем не менее половины титра этой сыворотки.

4. Определение активности поствакцинального или постинфекционного индивидуального или коллективного иммунитета.

5. Получение и определение титров иммунных диагностических, лечебных и профилактических сывороток, поли- и гамма-глобулинов.

6. Серологические реакции применяют при переливании крови, для определения групп крови, установления видовой и индивидуальной специфичности белков при трансплантации.

7. Судмедэкспертиза и определение связи инфекции с пищей.

Диагностическая сыворотка - иммунная сыворотка, содержащая антитела известной специфичностити в известном титре, и предназначенная для серологической идентификации микроба или для обнаружения антигенов в организме больного.

Титр сыворотки – максимальное разведение сыворотки (или минимальное её количество), в котором обнаруживаются Ат.

Диагностический титр – разведение сыворотки, в котором реакция положительна только у больных и отрицательна у здоровых. Для одной инфекции диагностический титр каждой серологической реакции свой.

Диагностикум - взвесь известных микробов или антигенов, предназначенных для серологической диагностики заболеваний по обнаружению антител в сыворотке больного.

Серонегативный период – стадия заболевания, в которой специфические Ат ещё не обнаруживаются, несмотря на наличие возбудителя («серологическое окно»).

Серопозитивный период – стадия заболевания, в которой специфические Ат обнаруживаются.

Сероконверсия – переход серонегативности в серопозитивность.

Серологический метод исследования включает ряд реакций: агглютинации, преципитации, связывания комплемента, иммунофлюоресценции, иммуиоферментного и радиоиммунологического анализа.

Оценка метода:

Достоинства: высокая специфичность, чувствительность, относительная простота, доступность, безопасность, быстрота (от 10 мин. до 4 часов) получения результатов, ретроспективность, ранний метод исследования АГ.

Недостатки: при острых инфекционных заболеваниях обнаружение АТ часто бывает

ретроспективным диагнозом, т.к. они появляются в достаточных титрах к 7-8 дню от начала болезни, и к этому сроку болезнь может закончиться. Бывают ложные результаты.