Вэжх в анализе препаратов, содержащих пропифеназон
Пропифеназон (4-изопропил-2,3-диметил-1-фенил-3-пиразолин-5-он; изопропилантипирин) относится к ненаркотическим анальгетикам пиразолонового ряда и входит в состав комбинированных безрецептурных препаратов. В настоящее время в лечебной практике широко используются таблетки каффетин (состав: пропифеназона—0,21 г, парацетамола—0,25 г, кофеина—0,05 г, кодеина фосфата—0,01 г) и саридон (парацетамола—0,25 г, пропифеназона—0,15 г, кофеина—0,05 г). Согласно существующей нормативной документации для подтверждения подлинности таблеток каффетина используется хроматография в тонком слое сорбента. Количественное определение предложено проводить в отдельных навесках препарата разными для каждого компонента методами: с помощью спектрофотометрии, титриметрии, сочетание тонкослойной хроматографии и спектрофотометрии. В нормативной документации на саридон парацетамол, кофеин и пропифеназон определяют методом ВЭЖХ на колонках длиной 12,5 см с сорбентом Merck Lichrospher C18 и подвижной фазой состава: метанол—0,01 М фосфорная кислота в соотношении 30:70.
Цель настоящей работы — разработка методик обнаружения и количественного определения компонентов таблеток каффетина и саридона с помощью ВЭЖХ.
В работе использовали таблетки каффетина производства «Алкалоид Скопье» (Республика Македония), саридона производства «Лаборатория Рош Николас С.А.», Гайярд (Франция) и субстанции компонентов, входящих в их состав. Исследование проводили на отечественном микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром-4» с УФ-спектрофотометрическим детектором, колонкой длиной 8 см с обращенно-фазовым сорбентом Сепарон-С18 в качестве неподвижной фазы. Полярный характер анализируемых соединений, их хорошая растворимость в воде и ацетонитриле обусловили выбор водно-ацетонитрильных смесей в разных соотношениях в качестве подвижной фазы. Были испытаны подвижные фазы ацетонитрил — вода в соотношениях 9:1; 7:3; 6:4; 8:2 и ацетонитрил—вода—диэтиламин (3:2:0,2). Избегали использовать подвижные фазы с объемной долей органического растворителя более 80%, чтобы исключить нормально-фазовые взаимодействия, затрудняющие дальнейшее регулирование состава подвижной фазы. Объемная доля растворителя менее 5% приводит к функциональной неустойчивости подвижной фазы и невоспроизводимости времен удерживания . Введение в состав подвижной фазы диэтиламина в качестве модификатора позволило добиться разделения всех 4 компонентов таблеток каффетин. Известно, что на поверхности октадецилсиликагеля находится значительное количество остаточных силанольных групп, способных к ионообменному взаимодействию. Диэтиламин исключает из хроматографического процесса силанольные группы, улучшает форму пиков, сокращает время анализа и регулирует рН на поверхности силикагеля. Измерение проводили в следующих условиях: масштаб регистрации 2,0, время удерживания 0,8 с, скорость расхода элюента 50 мкл/мин, объем вводимой пробы 3 мкл. Детекцию пиков осуществляли при 2 длинах волн — 238 и 276 нм.
Идентификацию проводили по параметрам удерживания, которые определяли предварительно на стандартных растворах исследуемых веществ.
Компоненты таблеток каффетина разделены при использовании подвижной фазы ацетонитрил—вода—диэтиламин (3:2,2:0,2). Время удерживания парацетамола составило 3,08 мин, пропифеназона — 5,73 мин, кофеина — 4,0 мин, кодеина — 4,67 мин.
Компоненты саридона можно также разделить, используя подвижную фазу ацетонитрил—вода (8:2). Время удерживания для парацетамола — 3,9 мин, пропифеназона — 5,11 мин, кофеина — 4,44 мин.
Для количественного определения применяли метод абсолютной калибровки. Прямая пропорциональная зависимость концентрации вещества от высоты пика наблюдалась для парацетамола в диапазоне 50—200 мкг/мл, для пропифеназона — 25—128 мкг/мл, кофеина — 20—50 мкг/мл, кодеина — 59—234 мкг/мл.
Метод ВЭЖХ имеет некоторые ограничения в анализе сложных смесей. При одновременном присутствии в смеси веществ в макро- и микроколичествах возникает перегрузка колонки, что оказывает влияние на качество разделения и форму выходящих пиков. В каффетине содержание кодеина фосфата по отношению к парацетамолу и пропифеназону в 21—25 раз меньше, поэтому рекомендуется жидкостная экстракция для отделения кодеина от остальных компонентов таблеток. Предварительно мы установили, что парацетамол, пропифеназон и кофеин извлекаются при однократной экстракции этилацетатом из водных растворов при рН 2,0 в количестве соответственно 87,43, 87,29 и 87,84%, а кодеин полностью остается в водном растворе и для его извлечения и концентрирования необходимо использовать хлороформ при рН 9,0—10,0.
Методика количественного определения парацетамола, пропифеназона и кофеина в таблетках саридона и каффетина. 20 таблеток растирают в ступке в мелкий однородный порошок, отвешивают около 0,01 г (точная навеска) порошка растертых таблеток и помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл ацетонитрила и тщательно перемешивают.
Содержимое колбы доводят до метки ацетонитрилом, перемешивают и фильтруют. Раствор вводят в колонку хроматографа в объеме 3,0 мкл. Содержание парацетамола, пропифеназона и кофеина определяют методом абсолютной калибровки. Результаты определения приведены в табл. 1 и 2, из которых видно, что полученные данные укладываются в допустимые пределы содержания по нормативной документации (НД).
Методика количественного определения кодеина фосфата в таблетках каффетина. Около 0,2 г растертых таблеток (точная навеска) растворяют в 20 мл воды, хорошо перемешивают до получения однородного раствора, фильтруют через фильтр для мелких и самых мелких осадков, фильтр промывают 10 мл очищенной воды. Раствор подкисляют 10% раствором серной кислоты до рН 2,0. Экстрагируют трижды этилацетатом порциями по 10 мл. Экстракты отбрасывают. К водному раствору добавляют 25% раствор аммиака до рН 9,0—10,0. Экстрагируют трижды хлороформом порциями по 10 мл. Объединенные хлороформные вытяжки помещают в фарфоровые чашки и испаряют при комнатной температуре. Сухие остатки растворяют в ацетонитриле, переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки тем же растворителем. 3 мкл полученного раствора вводят в колонку хроматографа и определяют кодеин в описанных условиях. Результаты определения приведены в табл. 3.
Для оценки точности предлагаемых методик и проверки воспроизводимости результатов были приготовлены и исследованы модельные смеси. Данные на примере таблеток саридона приведены в табл. 4. Как видно из табл.4, относительная погрешность определения не превышает для парацетамола ±1,19%, пропифеназона ±1,16%, кофеина ±1,63%.
Методика количественного определения компонентов таблеток саридона в модельных смесях. Отвешивают точные навески парацетамола (около 0,08 г), пропифеназона (около 0,05 г) и кофеина (около 0,016 г), переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в небольшом объеме ацетонитрила и доводят до метки тем же растворителем. Отбирают аликвоту 2,5 мл и переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, объем до метки доводят тем же растворителем, перемешивают и фильтруют. Раствор вводят в колонку хроматографа в объеме 3 мкл.
Выводы
1. Разработана методика обнаружения компонентов таблеток каффетина и саридона с помощью ВЭЖХ.
Время удерживания для парацетамола составило 3,08 мин, для пропифеназона — 5,73 мин, кофеина — 4 мин и кодеина — 4,67 мин.
2. Предложен метод ВЭЖХ для количественного определения компонентов таблеток каффетина и саридона.
Относительная ошибка определения составила для парацетамола ±1,19—1,21%, пропифеназона ±1,16—1,71%, кофеина ±1,22—1,63% и для кодеина ±2,95%.
Сравнительный анализ растворимых шипучих таблеток аце-тилсалициловой кислоты«Таспир» и «Upsarin upsa»
Цель исследования [2] — определение относительной биодоступности и биоэквивалентности шипучих таблеток «Таспир» производства «Татхимфармпрепараты» (Россия) в сравнении с шипучими таблетками «Upsarin UPSA» фирмы «UPSA» (Франция).Ацетилсалициловая кислота (АСК) широко применяется в медицинской практике в виде шипучих растворимых таблеток, преимуществом которых является уменьшение раздражающего действия кислоты на слизистую желудка. Кроме активного вещества, шипучие таблетки содержат такое соотношение органических пищевых кислот и карбонатов, которое позволяет полностью или частично пройти реакции нейтрализации при попадании таблетки в воду. Казанским производственным химико-фармацевтическим объединением (КПХФО) «Татхимфармпрепараты» разработаны состав и технология растворимых шипучих таблеток «Таспир», содержащих 0,3 г АСК. В состав шипучей смеси введено новое вспомогательное вещество — двухосновная пищевая янтарная кислота, которая входит в число пищевых кислот цикла Кребса, представляет собой универсальный внутриклеточный метаболит, широко участвующий в обменных реакциях в организме человека, стимулирует клеточное дыхание и оказывает кардиопротекторное действие. Установлено усиление противовоспалительной активности АСК в шипучих таблетках в сочетании с янтарной кислотой.
Материал и методы. Испытуемый препарат (Т): ≪Таспир≫, таблетки шипучие по 300 мг № 10, КПХФО ≪Татхимфармпрепараты≫ (Россия). Серия препарата — 9032000, срок годности до 04.02. Препарат сравнения (R): ≪Upsarin UPSA≫, таблетки шипучие по 500 мг № 16, фирма ≪UPSA≫ (Франция). Серия — Е0067, срок годности до 01.04.
Фармакокинетическое исследование проводили по перекрестной схеме. Для этого 18 здоровых добровольцев — 9 мужчин, средний возраст 26 (21—44) лет, масса тела 71 (62—82) кг, рост 181 (174—194) см и 9 женщин, средний возраст 28 (21—35) лет, масса тела 61 (53—69) кг, рост 169 (164—174) см — методом простой рандомизации разделили на 2 равные группы. В случайном порядке 9 волонтеров принимали сначала испытуемый препарат (таспир), а через 7 дней — препарат сравнения (Upsarin UPSA); добровольцы другой группы принимали препараты в обратном порядке.
Препараты принимали per os в 9 ч утра. Мерным цилиндром отмеряли 200 мл кипяченой воды и полностью растворяли в ней 1 таблетку ≪Таспира≫ (300 мг АСК). Затем отмеряли 330 мл кипяченой воды, полностью растворяли в ней 1 таблетку ≪Upsarin UPSA≫ (500 мг) и потом отмеряли 200 мл этого раствора. Добровольцы принимали 200 мл водного раствора одного из препаратов, который содержал 300 мг АСК. Кровь брали из кубитальной вены в количестве 5 мл в стеклянные пробирки до приема препарата и через 10, 15, 20, 30, 45 мин и 1, 1,5, 2, 3, 4, 6, 8 ч после его приема. Пробы крови центрифугировали 15 мин при 4°С и отбирали 1,5 мл плазмы.
Анализ проводили не позднее 2 ч после отбора проб. Концентрацию салициловой кислоты в плазме крови добровольцев определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Препараты и реактивы: субстанция салициловой кислоты (ФАРМ,≪Авогадро≫, Россия); ацетонитрил (ТУ 6-09-5497—91); диэтиловый эфир (медицинский); о-фосфорная кислота (85%, чда); хлористоводородная кислота (37%); вода — бидистиллированная.
Экстракция. К 1 мл плазмы добавляют 200 мкл смеси 0,2 М НСl и 0,2 М о-фосфорной кислоты (50:50), перемешивают на vortex 1—2 с.
Затем добавляют 10 мл диэтилового эфира и экстрагируют 10 мин. Пробы центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Органический слой количественно переносят в колбы для упаривания и упаривают на роторном испарителе досуха. К сухому остатку добавляют 150 мкл подвижной фазы, встряхивают на vortex 10 с и аликвоту (100 мкл) наносят на колонку хроматографа. Анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе ≪Gilson≫ (Франция) с УФ-спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны при длине волны 237 нм.
Использовали обращеннофазную хроматографическую колонку: Диасорб 130-С16; 7мкм; 4•150 мм (Россия). Температура колонки 30°С.
Элюирование проводили мобильной фазой состава: вода — ацетонитрил — о-фосфорная кислота (74:18:0,09); рН мобильной фазы около 2,5. Мобильную фазу перед использованием дегазировали под вакуумом. Скорость элюирования 1 мл/мин. В указанных условиях время выхода салициловой кислоты на хроматограмме 8,7±0,2 мин.
Количественное определение салициловой кислоты проводили методом абсолютной калибровки по площади пиков с использованием интегратора ≪Shimadzu≫. Калибровочная зависимость носила линейный характер в диапазоне концентраций 1—50 мкг/мл. Калибровочный график описывался линейным уравнением вида: у=а+b . х, где у — концентрация препарата (в мкг/мл), а = 0,000027; b = 0,005948; х — площадь хроматографического пика препарата. Коэффициент регрессии r=0,9997.
Предел обнаружения 0,5 мкг/мл.
Фармакокинетические параметры рассчитывали с помощью программы Kinetica ТМ2000 модельно-независимым методом. Полученные экспериментальные данные статистически обработаны с помощью пакета Systatw5 для персонального компьютера.
Результаты исследования
Усредненные фармакокинетические кривые салициловой кислоты после однократного перорального приема 300 мг АСК из препаратов ≪Таспир≫ и ≪Upsarin UPSA≫ представлены на рисунке. При анализе усредненных фармакокинетических кривых таспира и Upsarin UPSA видно, что они практически совпадают. После приема как препарата сравнения, так и испытуемого препарата метаболит аспирина салициловая кислота достигал максимального уровня к 45 мин (23,43±1,43 и 22,79±1,55 мкг/мл соответственно).
Результаты расчетов фармакокинетических параметров препаратов ≪Таспир≫ и ≪Upsarin UPSA≫ приведены в табл. 1 и 2. Как видно из приведенныхданных, фармакокинетические параметры салициловой кислоты после приема таспира и Upsarin UPSA статистически достоверно не различались.
Параметры относительной биодоступности салициловой кислоты после однократного приема шипучих таблетированных лекарственных форм представлены в табл. 3, из которой видно, что среднее значение относительной биодоступности таспира по отношению к Upsarin UPSA составляет 1,02, а величина отношения максимальных концентраций — 1,04.
Значения отношений максимальной концентрации к площади под фармакокинетической кривой Cmax/AUCo-∞ для препаратов ≪Таспир≫ и ≪Upsarin UPSA≫ статистически достоверно не различались и составили в среднем 0,22±0,01 и 0,24±0,02 соответственно.
Таким образом, не выявлено статистически достоверных различий в процессе всасывания (как по полноте, так и по скорости) препаратов ≪Таспир≫ и ≪Upsarin UPSA≫.
Вывод
Испытуемый препарат ≪Таспир≫ биоэквивалентен препарату сравнения ≪Upsarin UPSA≫.
