2. Знакомство с устройством и работой автоклава, сухожаровой печи

5. Подведение итогов занятия – 5 минут

ЗАНЯТИЕ 12

ТЕМА Генетика микроорганизмов. Мутации. Генетические рекомбинации: трансформация. Бактериофаги

Цель занятия. Познакомить студентов с понятием «мутации» микроорганизмов, типами мутаций; методами выявления спонтанных мутаций в популяции бактерий: а) флуктуационный тест; б) опыт Ньюкомба; в) метод реплик; с механизмами мутаций, использованием мутаций в практической деятельности. Познакомить студентов с морфологией бактериофага, методами изучения и обнаружения, изучить препараты фага для лечения, диагностики и профилактики

Методические указания к практической работе студентов

Продолжительность занятия: 3 академических часа (135 минут)

Место проведения занятия: учебная аудитория

Материально-техническое оснащение – таблицы, стенды, микроскопы, микропрепараты, вакцины

Хронометраж практического занятия:

1. Вводное слово преподавателя – 5 мин

2. Проверка исходного уровня знаний (тест-контроль) – 15 мин

3. Разбор теоретических вопросов по теме – 80 мин

1. Понятие «ген»

2. Мутации спонтанные и индуцированные

3. Молекулярный механизм мутаций

4. Мутагены

5. Ауксотрофы. Получение ауксотрофных штаммов бактерий

6. Механизмы генетических рекомбинаций

7. Трансформация

8. Понятие «бактериофаг»

9. Морфология, размер и химический состав фагов

10. Содержимое головки бактериофага

11. Этапы взаимодействия фага с микробной клеткой

12. Синтез фаговых частиц внутри микробной клетки

13. Различия между вирулентным и умеренным фагами

14. Лизогения и лизогенная конверсия

15. Методика определения титра фага по Грациа

16. Фаготипирование

4. Выполнение практической работы – 35 мин

Практическая работа

1. Изучить S- и R-формы бактерий (зарисовать)

2. Изучить методы, доказывающие спонтанные мутации у бактерии:

2.1. Изучить схему постановки флуктуационного теста (зарисовать схему)

2.2. Изучить схему постановки опыта Ньюкомба;

2.3. Изучить метод реплик (зарисовать)

3. Изучить схему трансформации (зарисовать)

4. Зарисовать схему строения бактериофага

5. Определить титр бактериофага

5.1. Изучение схемы титрования фага на жидких средах по методу Аппельмана. Определить титр фага таблице 7. Оформить протокол.

Титрование фага по Аппельману

Титрование фага проводят для того, чтобы определить его активность, которая выражается титром. Титр фага – то наибольшее разведение, в котором произошел лизис тест-микроорганизмов в условиях опыта (обозначается 10^-4 и т.п.).

В десять пробирок помещают по 4,5 МПБ. Методом переката готовят последовательные разведения фага, для чего в первую вносят 0,5 мл гомологичного фага (разведение 10^-1), сменив пипетку, содержимое пробирки перемешивают, затем берут 0,5 мл и переносят во вторую (разведение 10^-2) и т.д. до десятой пробирки (разведение 10^-10), меняя каждый раз пипетку. Далее в них вносят по 1 капле четырехчасовой взвеси тест-культуры, помещают в термостат и через 18–20 часов проводят учет результатов.

Учет результатов начинают с контроля, в этой пробирке должен наблюдаться рост культуры, содержимое пробирки станет мутным. Фаг должен подействовать на культуру и лизировать ее, содержимое пробирки станет прозрачным. В пробирках, где оказался хотя бы один фаг, роста культуры не будет.

Таблица 7

Схема титрования фага по Аппельману

№№ пробирки	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Разведение фага	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7	10-8	10-9	10-10
Ингредиенты
МПБ, мл	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5
Испытуемый фаг, мл	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Взвесь микробов	1 к	1 к	1 к	1 к	1 к	1 к	1 к	1 к	1 к	1 к
Результаты	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+

Примечание: «-» – отсутствие роста культуры; «+» – рост культуры.

6. Изучение диагностических, лечебных и профилактических фагов (записать в тетрадь)

6.1. Коли-фаг (кишечный фаг). Коли-фаг предствляет собой безвредный для организма фильтрат фаголизата кишечных палочек, обладающий для организма способностью лизировать патогенные кишечные палочки. Применяется для лечения и профилактики кишечных инфекций. В зависимости от характера очага инфекции фаг применяется местно, подкожно и внутримышечно.

Бактериофаг сальмонеллезный групп АВСDЕ представляет собой фильтрат фаголизатов наиболее распространенных сальмонеллезных бактерий: S.parathyphi A, S.parathyphi B, S.typhi murium, S.heidelberg, S.cholerae suis, S.oranienburg, S.newport, S.dublin, S.anatum. Препарат выпускают в жидком виде (прозрачная жидкость светло-желтого или светло-коричневого цвета со вкусом мясопептонного бульона) и в таблетках с кислотоустойчивым покрытием: с пектином или с оболочкой из ацетилфталил-целлюлозы. Лечебное и санирующее действие основано на способности фага вызывать лизис сальмонелл. Фаг применяют для лечения детей и взрослых больных сальмонеллезами. Применяют через рот или в клизме. Для профилактики бактериофаг применяют через рот на предприятиях типа мясокомбинатов, в стационарах для предупреждения внутрибольничных инфекций.

Брюшнотифозный бактериофаг поливалентный представляет собой смесь бактериофагов, активных в отношении значительного числа циркулирующих на территории страны возбудителей брюшного тифа. Фаг применяют в массовом порядке для профилактики брюшного тифа, острых вспышек водного и пищевого происхождения, авариях на водопроводной и канализационной сетях, а также для предупреждения вторичных случаев заболевания в эпидемических очагах.

Дизентерийный бактериофаг поливалентный представляет собой фильтрат фаголизатов возбудителей бактериальной дизентерии – Sh.sonnei, Sh.flexneri, сконцентрированный высаливанием или методом ионообменной хроматографии, лиофилизированный и таблетированный. Фаг вызывает специфический лизис шигелл Зонне и Флекснера. Предназначен для лечения больных дизентерией, профилактики в очагах, санации реконвалесцентов.

Пиобактериофаг комбинированный представляет собой смесь фаголизатов стафилококкового, стрептококкового, коли, синегнойного и протейного фагов, способных лизировать соответствующие микробы. Пиобактериофаг предназначен для лечения инфекций, вызванных перечисленными выше микробами: кожных инфекций (карбункулы, фурункулы, абсцессы), гнойных инфекций (плевриты, маститы, циститы), ангин. Используют фаг и для профилактики при операциях на брюшной и грудной полостях. Применяют местно и вводят в полость.

Бактериофаг стафилококковый представляет собой фильтрат фаголизата стафилококковых бактерий, обладающий способностью специфически лизировать патогенные стафилококки. Применяют при лечении кожных инфекций (карбункулы, фурункулы), гнойно-осложненных ран, остеомиелитов, кишечных формах стафилококковой инфекции. Применяют местно в виде орошения, примочек, введения в очаг, введения в полость.

6.2. Изучение диагностических фагов.

Типовые фаги являются диагностическими и применяются для установления фаготипа возбудителя.

Типовые брюшнотифозные фаги представляют собой набор диагностических фагов, содержащих стерильные фильтраты брюшнотифозных палочек, для титрования возбудителя брюшного тифа, находящегося в «V» и «W» форме.

Типовые стафилококковые бактериофаги включают 23 типа, разделены на 4 литические группы, представляют собой стерильные фильтраты фаголизатов эталонных штаммов стафилококков, обладают строгой специфичностью литической активности, используются для внутривидовой дифференциации и эпидемиологического маркирования выделенных штаммов стафилококка.

Чумной бактериофаг диагностический представляет собой фильтрат фаголизата чумного микроба, содержит корпускулы гомологичного фага и обладает специфическим литическим действием в отношении чумного микроба, применяется для идентификации палочек чумы, выделенных из организма больных людей, грызунов, эктопаразитов.

5. Подведение итогов занятия – 5 минут

ЗАНЯТИЕ 13

ТЕМА. Бактериофаги (продолжение) Генетические рекомбинации: трансдукция, конъюгация. Плазмиды, их свойства, классификация. Мигрирующие генетические элементы (инвертированные последовательности, интегроны, транспозоны). Биотехнология

Цель занятия. Познакомить студентов с рекомбинативной изменчивостью, плазмидами, использованием плазмид и рекомбинантов в генной инженерии. Ознакомить студентов с мигрирующими генетическими элементами (инвертированные последовательности, интегроны, транспозоны). Биотехнология

Методические указания к практической работе

Продолжительность занятия: 3 академических часа (135 минут)

Место проведения занятия: учебная аудитория

Материально-техническое оснащение – таблицы, стенды, микроскопы, микропрепараты, вакцины

Хронометраж практического занятия:

1. Вводное слово преподавателя – 5 минут

2. Проверка исходного уровня знаний (тест-контроль) – 15 минут

3. Разбор теоретических вопросов по теме – 80 мин

1. Трансдукция. Виды

2. Свойства трансдуцирующих фагов

3. Конъюгация бактерий

4. Картирование хромосом

5. Понятие «плазмида»

6. Классы плазмид

7. Основные свойства плазмид

8. Основные функции F-фактора

9. Бактериоцины

10. Основные свойства Col- плазмид

11. Свойства R-плазмид

12. Конъюгативные плазмиды

13. Рекомбинантные молекулы ДНК

14. Генетический вектор

15. Методы обнаружения плазмид

16. Инвертированные последовательности, транспозоны, интегроны

17. Достижения генной инженерии

4. Выполнение практической работы – 35 мин

Практическая работа

1. Изучение схемы титрование фага по методу Грациа. Определить титр фага по таблице 8. Оформить протокол.

Этим методом можно одновременно с титром фага определить количество фаговых частиц в исследуемом материале. Метод основан на том, что каждая частица фага, фиксированная агаром, дает зону просветления (лизиса) на чашке с газоном чувствительного к нему микроба.

Титруемый фаг разводят от 10^-1 до 10^-9 (как в предыдущем опыте). В пробирки с расплавленным 0,7% мясо-пептоным агаром вносят 1 мл фага из каждого разведения и 0,1 мл смыва 4-х часовой культуры, чувствительной к фагу. Культуру и фаг тщательно перемешивают в агаре, после чего содержимое выливают на чашки Петри с 1,5% мясо-пептонным агаром. После застывания агара чашки переворачивают, подписывают и помещают в термостат на 24 часа. При учете подсчитывают количество стерильных пятен (негативных колоний фага). Учитываются только те чашки, на которых колонии фага четко отделены друг от друга. Результаты записывают следующим образом (табл.8):

Таблица 8