Колориметрические методы

Колориметрические методы, основанные на определении степени окраски соединений, образующихся в результате различных "цветных реакций":  а) метод Сомоджи (1933), в котором используется способность глюкозы восстанавливать гидрат окиси меди в закись меди, превращающей, в свою очередь, арсено-молибденовую кислоту в молибденовую лазурь. Этот метод неспецифичен, трудоемок и в настоящее время редко применяется в клинико-диагностических лабораториях;  б) метод Фолина-Ву (1919), состоящий в определении окраски молибдена синего, который образуется в результате восстановления тартрата меди в окись меди. Последняя, взаимодействуя с молибдотустенгоновой кислотой, дает цветную реакцию. Метод относительно прост: отрицательной стороной его является то, что между имеюшейся в крови глюкозой и получаемой окраской не существует строгой пропорциональности;  в) метод Крезелиус - Зейферт (1928, 1942) основан на восстановлении пикриновой кислоты в пикраминовую с последующим ее колориметрированием. Метод быстр, но не очень точен. Ошибка может превышать 10-20%. В связи с этим указанный метод имеет ориентировочное значение;  г) метод с антроновым реактивом по Моррису (1948) и по Роэ (1955). Антроновый метод заключается в колориметрировании цветного комплекса, образующегося в результате соединения антрона с углеводами. Точные результаты могут быть получены при наличии высокоочищенных химических реактивов и соблюдении постоянной температуры;  д) орто-толуидиновый метод Гультмана в модификации Хиваринена - Никилла (1962), состоящий в определении интенсивности окрашивания раствора, возникающего при взаимодействии орто-толуидина с глюкозой. Этот метод специфичен и точен, дает возможность определять "истинную" глюкозу и поэтому предлагается в качестве унифицированного. Недостатки заключаются в применении неорганических (уксусная кислота) и органических (ТХУ) кислот и этапа кипячения.  Схема реакций орто-толуидинового метода:  Белки крови + ТХУ ---> денатурация и осаждение  глюкоза (Н+, нагрев) -----> оксиметилфурфурол  оксиметилфурфурол + о-толуидин ------> сине-зеленая окраска

Глюкозооксидазные методы

Сегодня наибольшее распространение получили методы, основанные на использовании фермента - глюкозооксидазы.  Глюкозооксидаза катализирует перенос двух водородных атомов с первого углеродного атома глюкозы на кислород, растворенный в жидком реагенте. При этом в ходе реакции образуется в эквимолярных количествах перекись водорода. Т.е. концентрация образовавшейся перекиси водорода точно равна определяемой концентрации глюкозы. Следовательно, использование глюкозооксидазной реакции, трансформировало задачу определения концентрации глюкозы в задачу определения концентрации перекиси водорода, которая, как будет показано ниже, значительно проще первой. И здесь есть несколько способов, широко используемых сегодня в лабораторной практике.  Среди вышеперечисленных способов регистрации наибольшее распространение получил фотометрический биохимический метод, в котором молекулы перекиси водорода под действием фермента пероксидазы расщепляются с образованием активной формы кислорода - супероксид анион-радикала - О2- , который в свою очередь окисляет хромоген, что приводит к значительному изменению спектра поглощения хромогена.  Максимум поглощения реакционной смеси - (реактив + глюкоза) находится в области 500 нм. Соответственно, изменение оптической плотности конечной реакции на длине волны 480-520 нм пропорционально концентрации глюкозы, содержащейся в пробе.  Большая популярность данного метода определения глюкозы объясняется его высокой специфичностью и простотой выполнения. Метод можно реализовать как с применением обычного фотометра КФК-2, КФК-3 или минифотометров МКМФ-02 ,МИНИЛАБ 501, так и с помощью автоматических биохимических автоанализаторов.

Глюкозооксидазный метод признан сегодня одним из самых точных количественных методов определения глюкозы. В качестве биологического материала используется как сыворотка крови, так и цельная кровь. При работе с последней следует учитывать тот факт, что при взятии капиллярной крови доля сыворотки (плазмы) зависит от величины гематокрита, что может негативно отразиться на точности результата. Поэтому при определении глюкозы вышеописанным методом предпочтительно использовать сыворотку крови пациента.  Наряду с методом фотометрирования по конечной точке, несколько лет назад появились наборы, в которых реализован кинетический метод фотометрирования. Суть метода состоит в том, что при определенном соотношении активностей глюкозооксидазы и пероксидазы, скорость образования окрашенного соединения некоторое время после внесения пробы в рабочий раствор будет пропорциональна концентрации глюкозы в пробе. Преимущество такого метода состоит в том, что результат не зависит от наличия в пробе других соединений, поскольку поглощение последних стабильно во времени. Конечно, этот метод требует применения кинетического фотометра, однако сегодня это уже не проблема, так как во многих лабораториях имеются как импортные фотометры типа HUMALAISER (Германия), HOSPITEX (Швеция), Стат Факс и др., так и отечественные серии МИНИЛАБ.  Измерение концентрации глюкозы из цельной крови удобно выполнять с помощью приборов, работа которых основана на амперометрическом принципе измерения, при помощи специальных ферментных датчиков. Перекись водорода является крайне нестабильным химическим соединением, и она может служить источником заряженных частиц. Именно это и используется в ферментных датчиках мембранного типа или электрохимических элементах портативных глюкометров.

В измерительной ячейке, сконструированной как проточная, находится измерительная камера, с одной стороны ограниченная ферментной мембраной  На мембрану толщиной около 60 микрон специальным образом сорбирована глюкозооксидаза. С другой стороны мембраны к ней прижимается платиновый электрод.  Проба цельной крови (обычно 20 мкл) разводится в системном буферном растворе (эритроциты разрушаются), после чего подается по магистрали в проточную ячейку. Глюкоза, подвергается окислению под воздействием фермента глюкозооксидазы, находящейся на мембране. Образовавшаяся перекись водорода диффундирует через мембрану и окисляется далее в каталитической реакции под действием платины. Диффузия перекиси водорода на поверхность платины формирует ток, пропорциональный числу молекул Н2О2. Полученный таким образом сигнал обрабатывается прибором в соответствующее значение напряжения. Это измеренное значение пропорционально концентрации глюкозы в пробы.  В качестве примера приборов, использующих вышеописанный метод, назовем автоматические анализаторы глюкозы ЭКСАН (Латвия), БИОСЕН 5030/5040 (Германия) и отечественный полуавтоматический анализатор глюкозы АГКМ-01. Эти приборы особенно привлекательны для поликлиник, где анализ на глюкозу делают преимущественно из капиллярной крови.  Важным этапом в развитии методов клинической лабораторной диагностики стало появление "сухой химии". Естественно, одним из первых приложений этой технологии стала задача определения глюкозы в крови пациента. Первые приборы значительно уступали по точности традицинным лабораторным методам исследований. Однако, со временем, ряду фирм удалось разработать такие диагностические полоски и отражательные фотометры, которые обеспечили весьма высокую точность анализа. Компанией "Lifescan" были созданы уникальные тест-полоски и прибор к ним, которые удачно сочетают в себе аналитическую точность количественного ферментативного метода со скоростью и простотой "сухой химии".

В заключении следует упомянуть и о недостатках глюкозооксидазного метода. Образующаяся перекись водорода и супероксид анион-радикал могут окислять не только хромоген, но и другие вещества, присутствующие в биологической жидкости: аскорбиновую кислоту, мочевую кислоту, билирубин. При этом, соответственно, доля перекиси, принимающая участие в окислении хромогена, снижается, что приводит к занижению результата по глюкозе. Этот метод линеен, как правило, до 20-30 ммоль/л глюкозы.

Гексокиназный метод

Гексокиназный метод также состоит из двух последовательных реакций, но совершенно других:  Реакция регистрируется при 340 нм. по образованию НАДН. Этот метод является высокоспецифичным и не дает реакции с другими компонентами сыворотки крови. Гексокиназный метод считается референтным для определения глюкозы. Как правило, он линеен до 50 ммоль/л, что позволило его широко рекомендовать для клиник с эндокринологическими отделениями.  Из описанного разнообразия методов определения глюкозы сотрудники КДЛ могут решить для себя, какой способ определения и какой прибор выбрать. Методы "мокрой" биохимии обеспечат нужды лабораторий с большим потоком анализов. Останавливаясь на диагностических наборах "жидкой" биохимии для определения глюкозы в клинической практике широко используются как глюкозооксидазный, так и гексокиназный метод. Из отечественных производителей наборов на глюкозу, отличающимися качественными характеристиками, можно выделить такие фирмы как Vital Diagnostics (C-Петербург), Вектор-Бест (Новосибирск); из зарубежных фирм - НUMAN (Германия), Лахема (Чехия).  Приборы типа BIOSEN, ESAT, АГКМ-01 требуют от оператора минимальных трудозатрат, так как они полностью автоматизированы. Они достаточно производительны (скорость от 50 до 90 проб в час). Для лабораторий с небольшим числом исследований, а также экспресс-лабораторий, глюкометры типа "ONE TOUCH" весьма полезны. Т.о., задача КДЛ - исходя из своих реальных возможностей, обеспечить не только быстрое, но и высокоточное определение глюкозы, на сегодняшний день вполне решаема.

Измерительный мост

Стоит рассмотреть измерительный мост как основной элемент в РЕА предназначених для измерения сопротивления путем сравнения с эталоном образцов. Рассмотрим подробно принцип действия элемента.

Измерительный мост (мост Уитстона, мостик Витстона) — устройство для измерения электрического сопротивления, предложенное в 1833 Самуэлем Хантером Кристи, и в 1843 году усовершенствованное Чарльзом Уитстоном. Мост Уитстона относится к одинарным мостам в отличие от двойных мостов Томсона. Электрический аналог рычажных аптекарских весов. Принцип измерения основан на взаимной компенсации сопротивлений двух звеньев, одно из которых включает измеряемое сопротивление. В качестве индикатора обычно используется чувствительный гальванометр, показания которого должны быть равны нулю в момент равновесия моста.

Неуравновешенный измерительный мост с вольтметром

На схеме , , ,  — плечи моста, AD — диагональ питания, CB — измерительная диагональ. представляет собой неизвестное сопротивление; , и  — известные сопротивления, причём значение может регулироваться. Если отношение сопротивлений равно отношению сопротивлений , то разность потенциалов между двумя средними точками будет равна нулю, и ток между ними не будет протекать. Сопротивление регулируется до получения равновесия, а направление протекания тока показывает, в какую сторону нужно регулировать .

С помощью гальванометра момент равновесия можно установить с большой точностью, и если сопротивления , и имеют малую погрешность, то может быть измерено очень точно, ведь даже небольшие изменения вызывают заметное нарушение баланса всего моста.

Таким образом, если мост сбалансирован (ток через гальванометр, сопротивление которого можно обозначить как , равен нулю), эквивалентное сопротивление цепи будет:

в параллели с , то есть