Реакция нейтрализации вирусо

Реакция нейтрализации основана на способности специфических вируснейтрализующих антител блокировать инфекционные, гемагглютинирующие, гемадсорбирующие, цитопатические, бляшкообразующие и др. свойства вирусов.

Она применяется в двух направлениях: 1) для идентификации вирусов; 2) для серодиагностики вирусных инфекций, т.е. для определения нарастания титра вируснейтрализующих антител в «парных» сыворотках. Компоненты: 1. Исследуемый вирус (при идентификации выделенною вируса) или исследуемая сыворотка (при серодиагностике инфекции). 2. Диагностическая (группе-, видо-, типоспецифическая) сыворотка (при идентификации вируса) или известный вирус — диагностикум (при серодиагностике). 3. Индикаторный объект: животные, куриные эмбрионы, культуры тканей или эритроциты.

Реакции нейтрализации т У!УО ставят в культурах клеток, куриных эмбрионах и на лабораторных животных.

Принцип. Смесью вирус (исследуемый или известный) + сыворотка (диагностическая или исследуемая), выдержанной в течение определенного времени, заражают культуру клеток, куриный эмбрион или лабораторное животное. При (+} реакции, т.е. при нейтрализации вируса антителами индикаторные объекты продолжают нормально существовать, а в контроле — гибель или характерные изменения.

Реакция нейтрализации — реакция торможения гемагглютинации (РТГА).

РТГА применяется: -для серотипирования вирусов; -для серодиагностики инфекций. Выделяют два способа постановки: - капельный способ на стекле (ориентировочная реакция), применяется для серо копирования вирусов; - развернутый в пробирках.

Механизм. У некоторых вирусов (например, гриппа) есть гемагглютинин, вызывающий агглютинацию эритроцитов различных животных, в зависимости от вида вируса. При наличии в сыворотке антител — антигемагглютининов наблюдаются инги-бирования активности вирусов. РТГА. Цель: серотипирование вируса гриппа А

Компоненты: 1. Исследуемый материал — аллантоисная жидкость куриного эмбриона, 2. Диагностические противогриппозные типоспецифиче-ские сыворотки, 3. 5 % взвесь куриных эритроцитов. 4. Физиологический раствор.

Реакция ставится на стекле капельным способом. На стекло наносят по 1 капле диагностических сывороток и исследуемого материала, перемешивают, затем добавляют 1 каплю взвеси эритроцитов. При положительной реакции наблюдается гомогенное покраснение, а при отрицательной выпадение хлопьев красного цвета (гемагглютинация).

Лабораторная диагностика вирусных инфекций

Серологические методы диагностики вирусных инфекций. Торможение гемагглютинации. Торможение цитопатического эффекта интерференцией вирусов. Прямая иммунофлюоресценция. Иммуноэлектронная микроскопия.

При большинстве вирусных инфекций развиваются иммунные реакции, применяемые для диагностики. Клеточные реакции обычно оценивают в тестах цитотоксичности лимфоцитов в отношении инфекционных агентов или заражённых ими клеток-мишеней либо определяют способность лимфоцитов отвечать на различные Аг и митогены. В работе практических лабораторий выраженность клеточных реакций определяют редко. Большее распространение нашли методы идентификации противовирусных AT.

РН основана на подавлении цитопатогенного эффекта после смешивания вируса со специфичными AT. Неизвестный вирус смешивают с известными коммерческими антисыворотками и после соответствующей инкубации вносят в монослой клеток. Отсутствие гибели клеток указывает на несоответствие инфекционного агента и известных AT.

Торможение гемагглютинации

РТГА применяют для идентификации вирусов, способных агглютинировать различные эритроциты. Для этого смешивают культуральную среду, содержащую возбудитель, с известной коммерческой антисывороткой и вносят в культуру клеток. После инкубации определяют способность культуры к гемагглютинации и при её отсутствии делают заключение о несоответствии вируса антисыворотке.

Торможение цитопатического эффекта интерференцией вирусов

Реакцию торможения цитопатического эффекта за счёт интерференции вирусов применяют для идентификации возбудителя, интерферирующего с известным цитопатогенным вирусом в культуре чувствительных клеток. Для этого в культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят коммерческую сыворотку (например, к вирусу краснухи при подозрении на неё), инкубируют и заражают вторую культуру; через 1-2 дня в неё вносят известный цитопатогенный вирус (например, любой ЕСНО-вирус). При наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, что первая культура была заражена вирусом, соответствовавшим применённым AT.

Прямая иммунофлюоресценция

Среди прочих тестов наибольшее распространение нашла реакция прямой иммунофлюоресценции (наиболее быстрая, чувствительная и воспроизводимая). Например, идентификация ЦМВ по цитопатогенному эффекту требует не менее 2-3 нед, а при использовании меченых моноклона л ьных AT идентификация возможна уже через 24 ч. Имея набор подобных реагентов, их можно вносить в культуры, заражённые вирусом, инкубировать, отмывать несвязавшийся реагент и исследовать с помощью люминесцентной микроскопии (позволяет выявить наличие флюоресценции заражённых клеток).

Иммуноэлектронная микроскопия

Иммуноэлектронная микроскопия (аналог предыдущего метода) позволяет идентифицировать различные виды вирусов, выявленные электронной микроскопией (например, различные виды герпесвирусов), что невозможно сделать, основываясь на морфологических особенностях. Вместо антисывороток для идентификации используют помеченные разными способами AT, но сложность и дороговизна метода ограничивают его применение.

В последнее время для экспресс-диагностики вирусных инфекций используют также ряд методов, направленных на выявление вирусов или их компонентов в различных видах клинического материал. По сути их можно отнести к методам вирусологической или серологической диагностике; их отличает высокая специфичность и чувствительность. Реакция иммунофлюоресценции. РИФ применяют в прямом и непрямом вариантах (см. подразд. 1.4.5) для выявления вируса в материале, полученном от больных, в инфицированных культурах клеток и организме животных (табл. 3.2). Иммунная электронная микроскопия. ИЭМ позволяет обнаружить специфически связанные с антителами вирусные частицы. Преимуществом этого метода является одновременная концентрация вируса и его идентификация с помощью специфической сыворотки. Предложенные модификации ИЭМ предусматривают обработку вирусосодержащего материала антисывороткой в высоком титре, добавление к осадку фосфорно-вольфрамовой кислоты или уранилацетата с последующим нанесением на пленку (подложку) и высушиванием. При электронной микроскопии видны скопления вирусных частиц. ИЭМ используют также для выявления в биологическом материале полиовирусов, цитомегаловирусов, вирусов гепатита А и В, некультивируемых аденовирусов в ткани миндалин, некульти- вируемых энтеро- и ротавирусов в фекалиях, вирусов оспы в оспенном детрите. Таблица 3.2 Диагностика вирусных инфекций при помощи РИФ Материал для иммунофлюоресцентного исследования Вирусная инфекция от больных для экспресс- диагностики из инфицированных культур клеток и животных для выявления и идентификации вируса Грипп Парагрипп Аденовирус ная Респиратор но-синци тиальная Корь Спущенные эпителиальные клетки носовых ходов, кусочки легких и трахеи, полученные при аутопсии То же Соскоб с конъюнктивы То же Эпителиальные клетки в осадке мочи, смывы из глотки, лейкоциты крови, биопсийные и секционные препараты мозга

Первичные культуры клеток почек обезьян, эпителиальные клетки носовых ходов от экспериментально зараженных хорьков Культуры клеток почек обезьян, эмбрионов человека, СОЦ, НЕр-2 Культуры клеток (Held, НЕр-2, КВ и др.) Культуры клеток (НЕр-2, Не1а\ диплоидные человека) Краснуха Энтеровирус - ная Секционные препараты миокарда (Коксаки), эпителиальные клетки в осадке мочи Культуры клеток почек кролика, обезьян, RK, Vero, SIRK,ВНК-21 Культуры клеток почек обезьян Культуры клеток почек обезьян Паротит Бешенство Герпетиче ская Биопсийные препараты мозга Мазки из содержимого везикул, соскоба везикул и роговицы, секционные и биопсийные препараты мозга Культуры клеток почек обезьян, амниона человека, куриных фибробластов Мазки-отпечатки мозга и слюнных желез инфицированных мышей Культуры диплоидных клеток WI-38, фибробластов; срезы ткани мозга зараженных мышей Вирусная инфекция Материал для иммунофлюоресцентного исследования от больных для экспресс- диагностики из инфицированных культур клеток и животных для выявления и идентификации вируса Цитомегало- вирусная Ветряная оспа Натуральная оспа Арбовирусная Гепатит В Ротавирусная Лейкоциты крови Мазки из содержимого везикул Соскобы с макул и папул, мазки из содержимого везикул Лейкоциты крови (при крымской геморрагической, денге, колорадской лихорадках) Биопсийные и секционные препараты печени Клетки желудка и кишок в фекалиях Культуры диплоидных кле-ток R7-38, фибробластов То же Культуры клеток эпителиального происхождения Hela, Veroи др. Культуры клеток эмбриона курицы, почек эмбриона свиньи, ВНК-21, СПЭВ, ПЭС; препараты слюнных желез переносчиков, гемолимфа клещей Встречный иммуноэлектрофорез. РВИЭФ в вирусологической диагностике широко применяется для обнаружения в сыворотках больных не антител, а поверхностных антигенов (например, HBsAg у больных гепатитом В), а также для выявления других вирусных антигенов, имеющих отрицательный заряд.

На стеклянную пластину наносят слой агара. После затвердения в нем вырезают два параллельных ряда лунок. Антигены помещают в лунки, расположенные ближе к катоду, а антитела — в лунки, находящиеся ближе к аноду, и проводят электрофорез. HBsAg, имея отрицательный заряд, передвигается к аноду, а антитела — к катоду. Затем стекла помещают во влажную камеру и через 12 — 24 ч учитывают результаты реакции по образованию линий преципитации между искомым антигеном и антителом. Реакция гемадсорбции на твердой основе. РГадсТО можно считать сочетанием ИФА с РНГА. Высокая чувствительность реакции позволяет применять ее для экспресс-диагностики вирусных инфекций. Методика. Лунки полистироловых панелей одноразового использования обрабатывают иммунным глобулином (иммунной сывороткой) и вносят в них суспензию исследуемого материала, содержащего антиген. Через 30 — 60 мин лунки многократно промывают буфером, добавляют взвесь эритроцитов, покрытых специфическим иммуноглобулином, и спустя 30—60 мин определяют наличие гемагглютинации. Если в материале содержится специфический антиген, он соединяется с сывороткой, адсорбированной на поверхности лунок, и, в свою очередь, связывает иммуноглобулины на поверхности эритроцитов. В результате происходит агрегация эритроцитов (гемагглютинация). В описанной модификации реакция применяется для выявления антигенов ротавирусов и других вирусов в фекалиях больных. Молекулярно-биологические методы. ПЦР и другие методы генодиагностики, применяемые для экспресс-диагностики вирусных инфекций, детально описаны в подразд. 1.7. Выбор вышеперечисленных методов лабораторной диагностики отдельных вирусных инфекций определяется характером забо-левания, клиническими особенностями течения, биологически-ми свойствами возбудителя, периодом болезни и возможностями лаборатории.

ЛЕКЦИЯ № 5. Общая вирусология