MolBiol_sivolob

Розділ 9. Реплікація ДНК

У прокаріотів перемикання на неакуратний синтез, який дозволяє долати перешкоди, відбувається завдяки заміні ДНК-полімерази ІІІ

на полімеразу низької точності синтезу – ДНК-полімеразу V (полімераза активується у відповідь на несприятливі умови, наприклад, ультрафіолетове опромінювання). Ця полімераза вставляє напроти тимінового димеру дві довільні нуклеотиди (виникає мутація), після чого замінюється на ДНК-полімеразу ІІІ, яка продовжує точний синтез. Крім того, долати невеликі одноланцюгові прогалини при SOS-репарації допомагає ДНК-полімераза ІІ – полімераза низької точності синтезу. Аналогічно перемикання на полімерази низької точності (див. вище) відбувається і в еукаріотів за наявності в матриці пошкоджених основ, піримідинових димерів тощо.

Інший шлях здійснення реплікації через тиміновий димер у складі ма-

триці отримав назву постреплікативної (рекомбінаційної) репарації.

У разі наявності тимінового димеру реплісома може його обійти, залишивши прогалину в ланцюзі, що синтезується (рис. 9.27). У цьому випадку на місце прогалини шляхом гомологічної рекомбінації (див. наступний розділ) вставляється ділянка сестринської молекули ДНК. Прогалина, що залишається при цьому в сестринській молекулі, легко заповнюється ДНК-полімеразою. Таким чином, як і при SOS-репа- рації, пошкодження залишається і може бути виправлено пізніше завдяки ексцизійній репарації.

Тиміновий димер

Рекомбінація

Рис. 9.27. Постреплікативна (рекомбінаційна) репарація

305

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

Репарація дволанцюгових розривів

Точна репарація дволанцюгового розриву ДНК можлива лише під час реплікації, коли розірвана ділянка може бути відновлена завдяки використанню сестринської молекули як матриці за механізмом гомологічної рекомбінації (яка розглядатиметься в наступному розділі).

Вінших випадках цілісність розірваних молекул ДНК відновлюється

вконсервативному для всіх організмів процесі негомологічного з'єдннання кінців (NHEJ – Non-Homologous End Joining). З'єднуються при цьому будь-які кінці ДНК, що, за наявності великої кількості розривів, призводить до об'єднання ділянок різних хромосом, транслокацій тощо.

Ключову роль у процесі NHEJ відіграють білки Ku, які (у гетеродимерній формі) упізнають кінці ДНК, об'єднують їх у нековалентний

комплекс і рекрутують до цього комплексу низку інших білків. У складі комплексу відбувається розплітання кінцевих ділянок ДНК і пошук мікрогомології – коротких комплементарних (чи майже комплементарних) одноланцюгових ділянок, які належать різним молекулам (рис. 9.28). У результаті утворюється короткий дуплекс, зайві одноланцюгові ділянки відщеплюються нуклеазами, лігаза зшиває одноланцюгові розриви. Таким чином, у процесі з'єднання відбувається втрата кількох пар основ. Ця особливість NHEJ-системи використовується при рекомбінації імуноглобулінових генів (див. наступний розділ) з метою підвищення розмаїття їхніх послідовностей.

Білки Ku

Рис. 9.28. Негомологічне з'єднання кінців ДНК

306

Розділ 9. Реплікація ДНК

КОНТРОЛЬНІ ЗАПИТАННЯ

1.Що таке реплікон? Охарактеризуйте основні типи репліконів.

2.Дайте визначення реплікативної вилки. Яка різниця між двома ланцюгами ДНК, що синтезуються під час реплікації? Що таке фрагменти Оказакі?

3.Які ферментативні активності мають бактеріальні ДНК-полі- мерази? Порівняйте особливості й функціональне значення ДНК-по- лімераз І і ІІІ.

4.Опишіть основні риси просторової структури ДНК-полімераз.

5.Які спільні риси мають РНК- і ДНК-полімерази? У чому полягають принципові відмінності між ними?

6.Як здійснюється редагування помилок при синтезі ДНК?

7.Що таке реплісома? Назвіть її основні компоненти та їхнє функціональне значення.

8.Дайте визначення гелікази. Яку роль вона відіграє в реплікації? Що таке білки SSB?

9.Що таке праймер? Навіщо він потрібен, яка його хімічна природа, який елемент реплісоми його синтезує?

10. Яку роль виконує лігаза при реплікації ДНК?

11. Як забезпечується висока процесивність ДНК-полімерази?

12. Які топологічні проблеми виникають під час реплікації та за допомогою чого вони розв'язуються?

13. Дайте визначення ориджина. Як саме здійснюється ініціація реплікації в бактерій?

14. Укажіть особливості еукаріотичної системи реплікації порівняно з прокаріотичною.

15. Які ДНК-полімерази працюють в еукаріотичній клітині? Яка полімераза здійснює ініціацію реплікації?

16. Яку функціональну роль виконує теломераза? Опишіть механізм роботи цього ферменту.

17. Порівняйте ексцизійну репарацію основ і нуклеотидів.

18. Як здійснюється репарація місметчів у ДНК?

19. Яким чином відбувається репарація дволанцюгових розривів ДНК?

307

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

РЕКОМЕНДОВАНА ЛІТЕРАТУРА

Agarwal, S., Tafel, A.A., Kanaar, R. DNA double-strand break repair and chromosome translocations // DNA Repair (Amst). – 2006. – Vol. 5.

– Р. 1075–1081.

Baker, T.A., Bell, S.P. Polymerases and the replisome: machines within machines // Cell. – 1998. – Vol. 92. – Р. 295–305.

Demeret, C., Vassetzky, Y., Méchali, M. Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains // Oncogene. – 2001. – Vol. 20. – Р. 3086–3093.

Donmez, I., Patel, S.S. Mechanisms of a ring shaped helicase // Nucleic Acids Res. – 2006. – Vol. 34. – Р. 4216–4224.

Dutta, A., Bell, S.P. Initiation of DNA replication in eukaryotic cells // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. – 1997. – Vol. 13. – Р. 293–332.

Friedberg, E., Walker, G., Siede, W. DNA repair and mutagenesis.

– Washington, DC : ASM Press, 1995.

Hübscher, U., Maga, G., Spadari, S. Eukaryotic DNA polymerases // Annu. Rev. Biochem. – 2002. – Vol. 71. – Р. 133–163.

Joyce, C.M., Steitz, T.A. Function and structure relationships in DNA polymerases // Annu. Rev. Biochem. – 1994. – Vol. 63. – Р. 777–822.

Kornberg A., Baker T.A. DNA replication. – New York : W.H. Freeman and Company, 1992.

Kuriyan, J., O'Donnell, M. Sliding clamps of DNA polymerases // J. Mol. Biol. – 1993. – Vol. 234. – Р. 915–925.

Latt, W.L., de, Jaspers, N.G.J., Hoeijmakers, J.H.J. Molecular mechanism of nucleotide excision repair // Genes Dev. – 1999. – Vol. 13.

– Р. 768–785.

Lindahl, T., Wood, R.D. (1999) Quality control by DNA repair // Science.

– Vol. 286. – Р. 1897–1905.

Lohman, T.M., Bjornson, K.P. Mechanisms of helicase-catalyzed DNA unwinding // Annu. Rev. Biochem. – 1996. – Vol. 65. – Р. 169–214.

O'Donnell, M. Replisome architecture and dynamics in Escherichia coli //J. Biol. Chem. – 2006. – Vol. 281. – Р. 10653–10656.

Stillman, B. Cell cycle control of DNA replication // Science. – 1996.

– Vol. 274. – Р. 1659–1664.

Zakian, V.A. Telomeres: beginning to understand the end //Science.

– 1995. – Vol. 270. – Р. 1601–1606.

308

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

Гомологічна рекомбінація

Необхідною умовою для здійснення гомологічної рекомбінації

єзагальна гомологія між двома молекулами ДНК по всій довжині. Загальну модель початкового етапу гомологічної рекомбінації зо-

бражено на рис. 10.1. Ініціюючою подією є дволанцюговий розріз в одній з гомологічних молекул. Цей розріз “розширюється” шляхом 5'-екзонуклеазної деградації ДНК – у результаті в місці розрізу залишаються два одноланцюгові 3'-хвости. Один із них здійснює інвазію – утворює подвійну спіраль з антипаралельним ланцюгом інтактної гомологічної молекули ДНК. Інший ланцюг цієї останньої, відповідно, виштовхується з дуплекса у вигляді одноланцюгової D-петлі. D-петля (від displacement), разом із 3'-хвостом, здатна переміщуватись у пошуку гомології – максимальної комплементарності в межах подвійної спіралі, що утворилася між ланцюгами двох гомологічних молекул ДНК. На наступному кроці відбувається репараційний синтез ДНК: два 3'-кінці розірваної молекули ДНК подовжуються ДНК-поліме- разами з використанням у ролі матриць двох ланцюгів інтактної молекули. До цього моменту схема на рис. 10.1 є одночасно схемою точної репарації дволанцюгового розриву в одній із двох сестринських молекул ДНК під час реплікації.

Під час рекомбінації відновлення цілісності ДНК є тільки завершенням початкового етапу. У результаті інвазії та репараційного синтезу дві молекули ДНК об'єднуються в чотириланцюгову структуру з двома перехрестями ланцюгів – структурами Холідея (Robin Holliday). Кожна структура Холідея може переміщуватись (так звана міграція гілки), результатом чого є подовження гетеродуплекса – подвійної спіралі між двома майже комплементарними ланцюгами двох гомологічних молекул ДНК.

Вважається, що за схемою на рис. 10.1 відбуваються початкові стадії гомологічної рекомбінації в більшості прота еукаріотів. Але механізми цих процесів найкраще вивчені для бактерій. В E. coli два кінці розірваної молекули ДНК упізнаються комплексом трьох білків – recBCD (рис. 10.2), який має геліказну та екзонуклеазні активності. Комплекс починає рухатися, руйнуючи подвійну спіраль і одночасно деградуючи ДНК за рахунок своїх 5'- та 3'-екзонуклеазних активностей. У так званому χ-сайті (сайт підвищеної частоти рекомбінації в E. coli – послідовність довжиною вісім пар основ, що зустрічається із середньою періодичністю у 5 тис. пар основ) 3'-екзонуклеазна актив-

310

Розділ 10. Рекомбінація ДНК

ність гальмується, результатом чого є утворення одноланцюгового 3'-кінцевого хвоста. Цей хвіст відразу вкривається білком recА. Останній має два сайти зв'язування з ДНК, за рахунок першого з них і відбувається (у присутності АТР як кофактора) кооперативна взаємодія з одноланцюговою ДНК: молекули білка оточують полінуклеотидний ланцюг, формуючи на його поверхні праву спіраль. Саме цей комплекс і здійснює інвазію в подвійну спіраль інтактної гомологічної молекули ДНК: другий сайт взаємодії recА з ДНК використовується на цій стадії для утворення комплексу з двома ланцюгами гомологічних молекул ДНК. За умови комплементарності двох ланцюгів здійснюється гідроліз АТР, після чого recА втрачає спорідненість до ДНК, залишаючи сформований гетеродуплекс.

Рис. 10.1. Початкові стадії гомологічної рекомбінації

Повертаючись до останньої панелі на рис. 10.1, розглянемо окрему структуру Холідея. Як показано на рис. 10.3, її можна піддати ізомеризації, повернувши два дволанцюгові кінці на 180°. Саме у формі без перехрестя ланцюгів (праворуч на рис. 10.3) структура Холідея

311

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

фіксується завдяки її взаємодії з гомотетрамерним білком ruvA: білок зв'язується з центром хреста, утримуючи чотири одноланцюгові ділянки у приблизно планарній квадратній конфігурації (рис. 10.4, а). З ruvA та двома дуплексами, що виходять з хреста у протилежних напрямках, взаємодіє білок ruvВ (шість субодиниць, які оточують подвійну спіраль кільцем). RuvВ працює як АТР-залежна геліказа (або, швидше, як комплекс ремоделювання хроматину, див. рис. 6.16): два гексамери ruvВ генерують обертальні рухи подвійної спіралі у протилежних напрямках, що приводить до протягування ланцюгів через комплекс ruvА/ruvВ (рис. 10.4, б). Саме активність ruvВ і забезпечує переміщення структури Холідея – міграцію гілки з одночасним подовженням гетеродуплекса.

χ-сайт

RecBCD

RecA

3'

D-петля

Рис. 10.2. Механізм початкових стадій гомологічної рекомбінації в E. coli

Рис. 10.3. Ізомеризація структури Холідея

312

Розділ 10. Рекомбінація ДНК

а б

ruvB

ruvA

Рис. 10.4. (а): Комплекс ruvA зі структурою Холідея (1BDX, показано лише Сα-атоми білка та Р-атоми ДНК). (б): Схема переміщення структури Холідея за рахунок активності ruvB: стрілки вказують напрямок обертання дуплексів та напрямок руху ланцюгів через комплекс ruvA/ruvВ (колір стрілок збігається з таким ланцюгів)

Зі схеми на рис. 10.5 видно, як можна ототожнити протягування чотирьох полінуклеотидних ланцюгів із міграцією гілки. На схемі у два етапи проведено формальну ізомеризацію планарної конфігурації структури Холідея в конфігурацію з перехрестям: на першому етапі два ланцюги у складі хреста випрямляються, на другому – нижня частина отриманої конфігурації обертається на 180°. Очевидно, що зображене на рис. 10.4, 10.5 протягування ланцюгів через комплекс ruvA/ruvВ є еквівалентним зсуву перехрестя у правий бік.

Останньою подією рекомбінації є розділення (resolution) структури Холідея резольвазою – білком ruvС. Резольваза є ендонуклеазою, дві молекули якої взаємодіють з комплексом ruvА/ruvВ і двома ланцюгами хреста, розташованими один навпроти одного: є два рівноймовірні варіанти такого зв'язування. Отже, резольваза робить дволанцюговий розріз через хрест двома можливими шляхами (рис. 10.6). Після наступного зшивання розривів лігазою залишаються дві дволанцюгові молекули ДНК.

На рис. 10.6 показано ізомеризовану чотириланцюгову структуру з рис. 10.1 – дві структури Холідея з перехрестями перетворені на планарні (ділянки, синтезовані шляхом репарації, не позначено) – і результат її розділення. Із чотирьох можливих комбінацій розділення

313

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

двох структур Холідея показано дві. Одна з цих комбінацій викликає рекомбінацію (аналогічно, рекомбінантною є і пара розрізів 2 + 4): дві гомологічні молекули ДНК обмінялися ділянками й умовна “абетка”, якою позначено фрагменти ДНК, змінює регістр – великі літери замінюються на маленькі й навпаки. Пари розрізів 1 + 4 і 2 + 3 не приводять до рекомбінації. Таким чином, рекомбінація при розділенні структур Холідея відбувається з імовірністю 50 %.

5'

5'

5' 5'

5'

5'

5' 5'

5'

5'

Рис. 10.5. Спрощена схема комплексу ruvВ зі структурою Холідея з рис. 10.4 та її формальні перетворення у дві топологічно еквівалентні конфігурації. Остання конфігурація збігається з правою структурою Холідея з рис. 10.1. Кольорові стрілки вказують напрямок руху ланцюгів через ruvВ,

чорні – напрямок руху дуплексів і перехрестя

Незалежно від того, чи відбулася рекомбінація, усі продукти містять гетеродуплекси (середня частина всіх кінцевих молекул на рис. 10.6). Оскільки гетеродуплекси складаються з майже комплементарних ланцюгів, вони містять місметчі. Відповідно, кінцевою операцією, яка завершує процес гомологічної рекомбінації, є репарація цих місметчів описаною в попередньому розділі системою mutHLSU. На відміну від того, як ця система спрацьовує після реплікації, після рекомбінації ланцюг, де відбувається заміна нуклеотидів, обирається випадково. Наприклад, центральний фрагмент першої молекули на рис. 10.6 перетворюється або на В/В', або на b/b'. Якщо на цій ділянці розташований ген, шляхом репарації обирається один із його алелів – В або b. Отже, побічним ефектом рекомбінації є відоме в генетиці явище конверсії гена. Білки системи mutHLSU якимось чином

314