5 курс / Пульмонология и фтизиатрия / Лазерная_терапия_в_онкологии_Москвин_С_В_,_Стражев

Лазерная терапия в онкологии

Рис. 20. Кинетика фракций Т-лимфоцитов: Tа – активные розеткообразующие Т-клетки, Tх – Т-хелперы, Tс – Т-супрессоры (Skobelkin O.K. et al., 1991)

40 мВт/см2 соответственно; λ = 308 нм, УФ-спектр, 150 мВт, 200 мВт/см2) на показатели неспецифической противоопухолевой резистентности (ЕК) и некоторые неспецифические факторы общего иммунитета (комплемент, лизоцим, бета-лизины) интактных животных и животных-опухоленосителей. Освечивание проводилось однократно и многократно. Объектом ЛО служили неинбредные крысы (100) и инбредные мыши (80) линий C57BL/6 и BALB/c, в качестве экспериментальных систем использованы перевивные опухоли: меланома В-16, карцинома Льюиса и лимфосаркома Плисса.

Установлено, что однократное освечивание НИЛИ с длиной волны 633 нм интактных мышей линии C57BL/6 приводит к стимуляции активности ЕК в случае, если ЛО подвергалась область проекции тимуса (опыт – 48%, контроль – 29%, p < 0,05), менее эффективным оказалось то же воздействие на область бедра (опыт – 40%, контроль – 29%, p < 0,05). Аналогичное воздействие излучением ЛПМ с длиной волны 511 нм также вызывало стимуляцию ЕК во всех трёх вариантах опыта (освечивание области тимуса – 50%, селезёнки – 48%, бедра – 51%). Наиболее результативным оказалось ЛО области тимуса (p < 0,05). Многократное воздействие жёлто-зелёным НИЛИ (опухоль Льюиса) существенных сдвигов со стороны активности ЕК у опухоленосителей не вызывало. При изучении влияния УФ НИЛИ на клеточность лимфоидных органов и на некоторые индикаторы неспецифической резистентности у интактных животных показало, что наиболее чувствительным в условиях как однократного, так и многократного воздействия является общее число карио­

150

Особенности лечения и реабилитации онкологических больных

цитов тимуса; заметное его уменьшение во всех схемах эксперимента свидетельствует, по-видимому, о том, что ЛО может вызвать в организме развитие адаптационного синдрома. Остальные показатели в условиях опыта оказались относительно стабильными.

Таким образом, НИЛИ с разной длиной волны оказывает заметное влияние на многие показатели иммунитета и неспецифической резистентности у интактных животных и животных-опухоленосителей [Васильев Н.В. и др., 1987; Тарасенко Т.И., 1987].

Аналогичные исследования также проводились в Институте проблем онкологии им. Р.Е. Кавецкого АН УССР. В экспериментах использовано 1420 мышей обоего пола линий С57В1/6 и BALB/c, а также белых нелинейных, массой 18–25 г, 3–6-месячного возраста. Карциному лёгкого Льюиса перевивали подкожно в заднюю лапку мышам С57В1/6 путём инокуляции 0,05 мл суспензии, содержащей 3 × 105 опухолевых клеток. О росте опухолей судили по изменению их среднего диаметра, степень метастазирования оценивали по изменению массы лёгких, среднему количеству метастазов на одно животное, среднему диаметру метастатического узла, частоте метастазирования. Для получения специфических супрессоров гуморального иммунного ответа мышей иммунизировали внутривенно эритроцитами барана (ЭБ) в дозе 2 × 108 в 0,2 мл физиологического раствора. Клетки-супрессоры получали из селезёнки через 2 недели после иммунизации [Косинская Н.П., Гамалея Н.Ф., 1985]. Лейкоциты у здоровых и онкологических больных выделяли из периферической крови, мышиные лимфоциты получали из лимфоузлов, тимуса, селезёнки и костного мозга животных. Для ЛО лимфоцитов и ВЛОК использовали гелий-неоновый лазер (длина волны 633 нм), при освечивании лимфоцитов плотность мощности 5 мВт/см2, для лазерного освечивания крови мощность 5–8 мВт на выходе световода, 5 ежедневных процедур по 30 мин. Некогерентный красный свет (λ = 633 ± 5 нм) получали с помощью дифракционного монохроматора. Влияние ВЛОК на иммунологические показатели изучали у трёх групп:

–13 здоровых мужчин в возрасте 20–50 лет;

–30 неонкологических больных: 16 с пародонтозом и 14 с коллагенозами;

–25 больных раком шейки матки, подвергавшихся лучевой терапии. Кровь брали из локтевой вены через каждые четыре часа: в 9.00, 13.00,

17.00, 21.00, 1.00 и 5.00 ч, немедленно выделяли мононуклеарные клетки и определяли их розеткообразующую способность по методике, выявляющей активные Е-РОК (Еа-РОК). Влияние НИЛИ на суточный ритм Е-розеткообра- зования изучали после однократного ВЛОК, проводимого утром (9.00–9.30). Исследование суточного ритма антителообразования иммунизированных животных осуществляли, определяя количество антителообразующих клеток к ЭБ в селезёнке животных, иммунизированных ЭБ, в 9.00, 13.00, 17.00, 21.00, 1.00 и 5.00 ч, через 96 ч после иммунизации [Беньковская Н.П., 1989].

151

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Лазерная терапия в онкологии

Показано,чтостимуляцияфункциональнойактивностилимфоцитов in vitro врезультатеосвечиванияимеетдозозависимыйхарактер,приэтомнекогерент­ ный свет оказывает лишь незначительное влияние. Аналогичные эффекты наблюдали и в эксперименте у животных.

ВЛОК у больных раком шейки матки улучшает состояние иммунной системы (табл. 15).

Таблица 15

Влияние лазерного освечивания крови на некоторые иммунологические показатели у больных раком шейки матки в процессе лучевой терапии (Беньковская Н.П., 1989)

Важным результатом этих исследований стало обнаружение некоторых хронобиологических закономерностей влияния НИЛИ на иммунную систему, что может быть использовано для повышения эффективности лазеротерапии

[Шишко Е.Д. и др., 1989].

При изучении влияния ВЛОК на иммунный ответ у животных в зависимости от его суточной ритмики обнаружено, что количество антителообразующих клеток к ЭБ в селезёнке мышей имеет минимум в дневные (13.00) и максимум в ночные (5.00) часы. Иммунизация животных в 13.00 вызывает самый высокий уровень иммунного ответа по сравнению с иммунизацией в 21.00 и 5.00, независимо от времени его тестирования. Лазерное освечивание в различное время суток по-разному влияет на функциональную активность специфических супрессоров иммунного ответа; ЛО клеток-супрессоров в 21.00 повышает их активность, что проявляется в снижении иммунного ответа на ЭБ при переносе этих клеток мышам-реципиентам, тогда как ЛО в 5.00 угнетает их активность. При освечивании крови (8 сеансов по 10 мин) у мышей с привитой опухолью в утреннее и вечернее время наблюдалось заметное торможение роста первичной опухоли, которое составляло 23,9 ± 4,1 и 17,8 ± 4,8% соответственно, тогда как при ЛО в 13.00 торможение роста опухоли не достигало статистически достоверных различий. Метастазирование также было наименее интенсивным при ЛО в 21.00. Следует подчеркнуть, что ни

152

Особенности лечения и реабилитации онкологических больных

водном случае не обнаружено стимулирующего влияния НИЛИ на развитие первичной опухоли или метастазов у животных [Беньковская Н.П., 1989].

При изучении суточных ритмов Е-розеткообразующей способности лимфоцитов периферической крови доноров и фоточувствительности розеткообразующих клеток к красному свету обнаружено, что лимфоциты всех доноров имели закономерные суточные колебания Е-розеткообразующей активности с максимумом около полудня и минимумом около полуночи (различия между этими точками статистически достоверны). При освечивании активность лимфоцитов закономерно возрастала в каждой временнóй точке Е-РО лимфоцитов на разную величину, достигая при этом какого-то, определённого для данного донора, максимального уровня. Вероятно, процентное содержание клеток, образующих розетки только после предварительного освечивания, среди лимфоцитов периферической крови в течение суток закономерно изменяется, подчиняясь собственному циркадному ритму, и фоточувствительность всей популяции лимфоцитов в каждой временнóй точке суток определяется процентным содержанием в ней этой субпопуляции. Сразу после окончания однократной процедуры ВЛОК (9.00–9.30) количество Е-РОК возрастало в 1,15раза(p< 0,05),затемвтечение4часов снижалосьдоисходногоуровня;на протяжении суток колебания Е-розеткообразующей способности лимфоцитов характеризовались сдвигом фазы в сторону упреждения, через неделю после ВЛОК суточные колебания количества Е-РОК возвращались к исходному циркадному ритму [Беньковская Н.П., 1989].

Одними из первых закономерности влияния НИЛИ на иммунную систему животных с перевиваемыми опухолями стали изучать в НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН [Зырянов Б.Н. и др., 1998]. В работе использованы мыши (1340 животных) линии C57BL/6, обоего пола массой 18–20 г, для отработки каждой экспериментальной точки брали по 7–20 животных в опытной и контрольной группах. Использовались животные с перевивными сингенными опухолями – карциномой лёгких Льюиса (LLC) и меланомой В-16. Материал для перевивки LLC брали на 12–14-й день после трансплантации, вводили 0,2 мл опухолевого материала при разведении 1 г опухоли

в5 мл среды 199. Материал для перевивки меланомы брали на 16–20 дней, мышам вводили под кожу правого бедра 0,2 мл 20% взвеси опухолевых клеток

всреде 199.

Источники НИЛИ:

–гелий-неоновый лазер (ГНЛ, красный спектр): длина волны 633 нм, НР, мощность 2,5 мВт;

–лазер на парах меди (ЛПМ, жёлто-зелёный спектр): длина волны 511 и 578 нм (соотношение интенсивностей 2:1), импульсный режим, частота 5000 Гц, мощность до 150 мВт.

Определение активности ЕК проводили по мембранотоксическому тесту, разработанномувлабораторииклеточнойиммунологииибиотехнологииНИИ морфологии человека АМН СССР. В качестве клеток-мишеней использова-

153

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Лазерная терапия в онкологии

лись клетки эритромиелолейкоза человека К-562, меченные 3Н-уридином, поддерживаемые in vitro в среде RPMJ-1640 с 10% фетальной сывороткой FLOW. Клеточными эффекторами являлись клетки селезёнки опытных животных. Для предотвращения включения 3Н-уридина в клетки-эффекторы их предварительно обрабатывали актиномицином D в течение 1 часа при 37 °С с последующим отмыванием в среде 199 с добавлением инактивированной бычьей сыворотки и антибиотиков.

Мембранотоксический тест ставили в 96-луночных плейтах. В каждую ячейку помещали панкреатическую РНК-азу, 10 клеток-мишеней, разные количества тестируемых клеток (соотношение «эффектор–мишень» 100:1, 50:1, 25:1).Инкубациядлилась18часовпритемпературе37°Сватмосфере5%СО2, после чего содержимое ячеек отмывали физиологическим раствором, холодной 5% трихлоруксусной кислотой и 80° этанолом с помощью 12-канального собирателя фракций на фильтрах Flow lab № 78-105-06. Радиоактивность мишеней оценивали на счетчике Packard. Индекс мембранотоксичности вычисляли по формуле: ИМ = (1 – О/К) × 100, где О – количество импульсов в опытных лунках, К – количество импульсов в лунках с клетками-мишенями.

Опыты проводили на двух группах животных, по 3 подгруппы каждая. Первую группу составили интактные животные, которым проводили ЛО зоны тимуса, кожи бедра, и без ЛО (контрольная группа). Во вторую группу вошли животные-опухоленосители, которым проводили аналогичное ЛО, и без него (контрольная группа).

Эксперименты проведены в трёх вариантах, отличающихся друг от друга только кратностью (4, 5 и 6) сеансов ЛО, с интервалом в два дня. Освечивание на длине волны 633 нм начинали на 4-й день после перевивки опухоли, экспозиция 15 мин. Животных выводили из опыта на следующий день после последнего сеанса методом цервикальной дислокации.

Результаты опытов представлены на рис. 21–23. У контрольных животных первой группы киллинг при соотношении клеток-мишеней и клеток-эффек- торов 100:1 составил 28,8 ± 2,1%. У интактных мышей, которым освечивали

Рис. 21. Стимуляция активности ЕК у интактных животных после 5-кратного ЛО непрерывным красным (длина волны 633 нм) НИЛИ (Зырянов Б.Н. и др., 1998)

154

Особенности лечения и реабилитации онкологических больных

зону проекции тимуса, этот показатель был 43,0 ± 2,9%. Менее выраженная стимуляция активности ЕК получена при освечивании кожи на бедре (рис. 21).

Развитие опухоли у второй группы животных явилось мощным стимулятором ЕК, киллинг в этой ситуации достигал 63,0 ± 2,8%, но при ЛО опухоли на бедре этот показатель снизился до 26,0 ± 8,5%. Освечивание зоны тимуса

Рис. 22. Угнетение активности ЕК у животных-опухоленосителей после 4-кратного ЛО опухоли непрерывным красным (длина волны 633 нм) НИЛИ

(Зырянов Б.Н. и др., 1998)

Рис. 23. Угнетение активности ЕК у животных-опухоленосителей после 6-кратного ЛО опухоли непрерывным красным (длина волны 633 нм) НИЛИ

(Зырянов Б.Н. и др., 1998)

155

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Лазерная терапия в онкологии

у этих животных значимого изменения активности ЕК по сравнению с контролем не вызвало (рис. 22, 23).

Таким образом, качественно сходное воздействие привело к различным последствиям у интактных животных и у животных-опухоленосителей, если

впервой группе получили стимуляцию, а во второй – подавление активности ЕК-клеток. Причём у здоровых людей иммуномодулирующие эффекты не выявлены, как в отношении активности ЕК-клеток, так и фагоцитарной активности, но имеют место у больных меланомой [Скивка Л.М. и др., 1991]. Исследования in vitro также демонстрируют околосуточную ритмику естественной цитотоксичности и фагоцитарной активности лейкоцитов [Гамалея Н.Ф., 1991].

При обсуждении причин этого явления обращает на себя внимание различие ситуаций у неосвечиваемых животных. Если у интактных животных контрольной группы активность ЕК была относительно низкой, то во второй контрольной группе само развитие опухоли повышало активность клеток, тем самым, возможно, исчерпывался тот резерв, который мог потенциально мобилизоватьсявоздействиемНИЛИ.Мощныйэффектподавленияактивности ЕКкраснымнепрерывнымНИЛИ(633нм)уживотных-опухоленосителейпри локальномЛОопухолиотчётлив,статистическизначиминаблюдалсяпривсех соотношениях клеток-эффекторов и клеток-мишеней (рис. 22 и 23). Вероятно, локальное освечивание опухоли провоцирует выброс биологически активных веществ, обладающих сильным ингибирующим действием­ в отношении ЕК.

Чтокасаетсясамойопухоли,тонаблюдаласьтенденциякстимуляциироста

втой опытной группе, где было нарушение в звене ЕК, то есть у животных, которым проводили непосредственное ЛО опухоли красным непрерывным НИЛИ. При воздействии на зону тимуса стимуляции опухолевого роста не обнаруживалось (табл. 16).

Таблица 16

Влияние ЛО непрерывным НИЛИ красного спектра (633 нм) на рост меланомы у мышей C57BL/6

Итак, в условиях данных экспериментов воздействие красным непрерывным НИЛИ оказалась фактором, способным активно влиять на ЕК как у ин­ тактных­ животных, так и у животных-опухоленосителей. Однако характер этого влияния принципиально различен – если у интактных животных имело

156

Особенности лечения и реабилитации онкологических больных

место активация ЕК, то у животных-опухоленосителей, напротив, при локальном освечивании опухоли происходило угнетение активности клеток.

На следующем этапе эксперимента проверяли НИЛИ с другой длиной волны и мощностью (лазер на парах меди). Схема опытов была несколько модифицирована.

Первая серия опытов выполнена на интактных мышах линии BALB/c, разделённых на четыре подгруппы:

–ЛО зоны тимуса,

–ЛО кожи бедра,

–ЛО зоны селезёнки,

–контроль (без ЛО).

Воздействие проводили однократно, экспозиция 2 мин, животных выводили из опыта на 1-е, 2-е, 3-и сутки после окончания освечивания. Результаты эксперимента приведены на рис. 24. Активность ЕК оказалась весьма чувствительным тестом в условиях даже однократного освечивания зоны тимуса и селезёнки. Наиболее устойчив эффект стимуляции ЕК в случае ЛО области тимуса, статистически значимый сдвиг прослеживался на протяжении всех трёх дней эксперимента. При освечивании области селезёнки статистически достоверная стимуляция определялась в течение двух дней. Что же касается освечивания кожи в области бедра, то можно говорить лишь о наличии тенденции к стимуляции. Таким образом, импульсное излучение ЛПМ стимулирует активность ЕК клеток у интактных животных, причём эффект этот более выражен при воздействии на зону проекции органов, имеющих отношение к иммуногенезу.

Вторая серия опытов выполнялась на мышах линии C57BL/6, которым подкожно в область бедра инокулировали карциному Льюиса. Локальное ЛО опухоли начинали на следующий день после перевивки, проводили 7раз, ежедневно,по3мин.Выходнаямощностьизлучениябыларазличнавподгруппах: 45 и 100 мВт для λ = 511 нм; 45 мВт для λ = 578 нм. Животных выводили из опыта на следующий день после последнего освечивания.

Все три варианта опытов дали сходные результаты (рис. 25–27). Оказалось, что киллерная активность в условиях опухолевого роста излучением ЛПМ не угнетается. Отсутствует при этом и стимуляция НК, наблюдаемая в предыдущих экспериментах, при ЛО интактных животных. Рост экспериментальной опухоли у животных опытных групп замедлен по сравнению с контрольной группой (табл. 17).

Таким образом, отсутствие повреждающего действия излучения ЛПМ на функцию ЕК у животных-опухоленосителей совпало с умеренно выраженным угнетением развития у них экспериментальной опухоли.

Одним из препятствий, тормозящих дальнейший прогресс иммунотерапии злокачественных опухолей, является реакция ИС, связанная с антителообразованием [Волков Н.М., 2014]. В связи с этим представляет интерес выяснение влияния НИЛИ на гуморальный иммунный ответ, развивающийся на введение в организм тимусзависимого и тимуснезависимого антигенов.

157

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Рис. 24. Стимуляция активности ЕК у интактных животных импульсным НИЛИ жёлто-зелёного спектра (длина волны 511 и 578 нм). Сверху вниз – декапитация животных через 1, 2 и 3 суток (Зырянов Б.Н. и др., 1998)

158

Особенности лечения и реабилитации онкологических больных

Убольныхракомяичниковвпроцессемногомесячнойадъювантнойхимио­ терапии прогрессируют различные иммунные расстройства, затрагивающие преимущественно клеточное звено иммунной системы. Обоснованным и необходимым становится иммунокорригирующее лечение. Тимус претерпевает неспецифические возрастные атрофические изменения, связанные с усилением в нем процессов липоматоза, что выявлено при компьютерной томографии. Показано,чтоимпульсноелазерноеизлучениеприлокальномосвечиваниизон тимуса и селезёнки экспериментальных животных вызывает иммуномодули-

Рис. 25. Влияние импульсного НИЛИ (511 нм; 45 мВт) на активность ЕК у животных-опухоленосителей (Зырянов Б.Н. и др., 1998)

Рис. 26. Влияние импульсного НИЛИ (578 нм; 45 мВт) на активность ЕК у животных-опухоленосителей (Зырянов Б.Н. и др., 1998)

159

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/