2. Проведениедиагностическойбиопсиикожи

Объектамиисследованиябылипораженныеучасткикожи21больногоГМи21больногоБП,участкикожи16здоровыхлиц(полученныепослепластическихопераций),взятыеметодомпанч-биопсии.Дляпроведенияпанч-биопсииприменялиодноразовыйстерильныйтрубчатыйнождиаметром6мм(«Bloodline»,Италия)(Рисунок2.3,2.4).Использовалиинфильтрационнуюанестезию2%растворомлидокаина.

Рисунок2.3–Проведениепанч-биопсиитрубчатымножом

Рисунок2.4–Выделениеучасткакоживрезультатепроведенияпанч-биопсии

1. Гистологическоеисследование

Кусочкидлягистологическойобработкивырезалитак,чтобывмикроскопическомсрезесохранялисьтопографическиесоотношения,характерныедляисследуемогоматериала.Блокидляпроводкивырезалипослефиксации.

Биоптаткожипомещаливемкостьсфиксатором,объемфиксирующейжидкостипревышалв10–20разобъемфиксируемогообъекта.Еслиобъектбылразрезаннафрагментытолщинойболее5–6мм,егооставляливфиксаторена2–3часадляуплотнения,послечеготканьрассекалинапластинытолщиной2–3ммипомещаливсвежийрастворфиксатора.Общеевремяфиксацииприкомнатнойтемпературе(около20°С)составлялоот18до24часов.Вповседневнойработевкачествефиксирующейжидкостииспользовали10%растворформалинаилицинк-формалин,которыйобеспечиваетсохранениеантигенныхдетерминантдляпроведенияиммуногистохимическихисследований.

Обезвоживаниеипропитываниепарафиномбиоптатовкожипроводиливручнуюповосходящимспиртам(70%,80%,90%и100%)ваппаратегистологическойпроводкитканей«LeicaPeloris»(«LeicaMicrosystems»,Германия),заливаливпарафин.

Срезыприготовлялитолщиной3–4мкм.ИспользовалсямикротомротационныйAccu-Cut®SRM™200.Скаждогопарафиновогоблокаделали3–4препаратадлягистологическихокрасок,накаждомпрепаратеразмещали1–2среза.Однучастьпрепаратовокрашивалигематоксилином-эозином,сдругойчастьюматериалапроводилииммуногистохимическоеисследование.

Препараты,окрашенныегематоксилином-эозином,подвергалисьмикроскопическомуисследованию.Использовалсясветовоймикроскоп«OlympusBX-51»(Япония),оборудованныйцифровойкамерой«OlympusXС-10»ипрограммнымобеспечением«CellА»(Рисунок2.5).Исследованиеэпидермисаи

дермыпроводилосьнаувеличении×100,×200и×400.Вгистологическихпрепаратахопределялипатоморфологическиеизменениявэпидермисеидерме.

Рисунок 2.5 – Оборудование, используемое для приготовления иисследованиягистологическогопрепарата

2. .Непрямойиммуногистохимическийметодисследования

Начальнымэтапомнепрямогоиммуногистохимическогоисследованиябылаподготовкасрезов.Дляэтогоихнаклеивалинастекла,обработанныеполилизином,распарафинивали,блокировалиэндогеннуюпероксидазурастворомперекисиводородавметанолеивыполнялидемаскировкуантигеновпутемнагреваниявтрис-ЭДТАилицитратномбуферевтечение30минпритемпературе95°Снаводянойбане(рисунок2.6).

Дляиммуногистохимическойдетекциисубпопуляцийлимфоцитов,дендритныхклетокипролиферативнойактивностиклетокиспользовалипервичныемышиныеикроличьимоноклональныеантичеловеческиеантитела(Таблица2.2).Времяинкубацииспервичнымиантителамисоставляло18-20часовприt°=+40°C.

Рисунок2.6–Схемапроведениянепрямойиммуногистохимическойреакции

Таблица2.2–Первичныеантичеловеческиеантитела

Антиген	Антитело(клон)	Разведениеантител	Способ демаскировкиантигена	Производительантител
CD3ε	F7.2.38	1:600	трис-эдтабуфер,PH9,0	ThermoFisher Scientific,США
CD83	NCL-CD83	1:70	трис-эдтабуфер,PH9,0	Novocastra, Великобритания
Langerin(CD207)	NCL- Langerin	1:50	трис-эдтабуфер,PH9,0	Novocastra, Великобритания
Ki67	SP6	1:600	трис-эдтабуфер,PH9,0	ThermoFisher Scientific,США

ДлядетекцииклетокиспользовалиполимернуюсистемувизуализацииEnvision(Dako,Дания),гдевкачествехромогенаприменялидиаминобензидин(ДАБ)(Dako,Швеция),идвойнуюсистемувизуализацииMultivisionPolymer(ThermoFisherScientific,США).Инкубациюпроводилиссистемойвизуализации

–30мин.притемпературе+20°С.дляпроявлениярезультатареакцииДАБнаносилинасрезына5мин.

Двойнаясистемадетекции«MultivisionPolymerDetectionSystem:Multivisionanti-rabbit/HRP+anti-mouse/APpolymers»–набордляиммуногистохимическоговыявления(окрашивания)двухантигеновводномсрезе(гистологическомпрепарате).Онасостоитизсмесиантивидовыхантикроличьихантител,конъюгированныхспероксидазойхренаиантивидовыхантимышиныхантител,конъюгированныхсощелочнойфосфатазойидвухразныххромогенов(дополнительныереагенты).Пероксидазахренаприрасщеплениисвоегохромогенадаеткрасноеокрашивание,щелочнаяфосфатаза–синее.Даннаясистемапозволяетпроанализироватьвзаимноерасположениедвухразныхантигеновводномпрепарате,приусловии,чтохозяевапервичныхспецифическихантителкэтимантигенамразные–кроликимышь.

Выполнялосьопределениеколичестваокрашенныхцветовойметкой(позитивных)клетокпри200–кратномувеличениисветовогомикроскопавтрехполяхзрения(размерами720×530мкм),выбранныхсучетомнаибольшегоколичествамеченыхклеток,используякомпьютернуюпрограммуанализаизображения«UTHSCSAImageTool3.0»(Рисунок2.7)ипрограммноеобеспечение«Морфология5.2»(ВидеоТесТ,Россия)(Рисунок2.8,рисунок2.9,рисунок2.10).Полученныеданныезаносиливбазуданныхввидесреднегочислапозитивныхклетокнаизучаемойплощадисреза(0,38мм²),посчитанныхдлякаждогобиоптата.

Определялиотносительнуюплощадьэкспрессии,которуюрассчитываликакотношениеплощади,занимаемойиммунопозитивнымиклеткамикобщейплощадиклетоквполезрения,ивыражаливпроцентах.

ИндекспролиферативнойактивностиопределяликакотношениеколичестваKi-67-позитивныхклетоккобщемуколичествуядерныхклетоквполезрения,выраженноевпроцентах.

Коэффициентэпидермо-дермальногоотношенияопределяликакотношениеплощади, занимаемоевыявляемыммаркеромвэпидермисекплощадивдерме.

Рисунок2.7–Интерфейспрограммыанализаизображения«ImageTool3.0»

Рисунок2.8–Интерфейспрограммногообеспечения«Морфология5.2».

Детекцияопределяемыхклеток

а б

в г

Рисунок2.9Иммуногистохимическоеисследованиекожибольныхгрибовидныммикозом:а,в–домодификациипрограммой«Морфология»;б,г–модификацияизображенияпрограммой«Морфология».анти-CD3–желтоеокрашивание,анти-Ki-67–красноеокрашивание.а,б–увеличение×200;в,г–увеличение×400

Рисунок2.10–Интерфейспрограммногообеспечения«Морфология5.2».Определениеплощади, занимаемойиммунопозитивнымиклетками