ГИС. Для ГИС сейчас широко используют двухцепочечные ДНК-зонды и высокоспецифические термостабильные РНК-зонды. В зависимости от используемой метки нерадиоактивная in situ гибридизация делится на хромо-генную и флюоресцентную (рис. 2-4, 2-5, см. цв. вклейку).
Основные принципы ГИС состоят в следующем: срез ткани, прочно зафиксированный на специальном предметном стекле, обрабатывают протеазами и/или кислотой, чтобы облегчить зонду проникновение к ядерной ДНК, предварительно денатурированной нагреванием до 9598 °С. При наличии в срезе ДНК, комплементарной к зонду, происходит гибридизация одноцепо-чечной ДНК с внесенным зондом, несвязанный меченый зонд или ошибочно спарившуюся ДНК удаляют интенсивным промыванием, а связавшийся зонд выявляют иммуногистохимиче-скими методами. Методики выявления РНК и ДНК с помощью ГИС различаются, это относится ко всем этапам - от получения и фиксации клеток и тканей до выбора способов детекции. Выбор того или иного варианта методики, зонда, детекционной системы зависит от задач конкретного исследования. Анализ препаратов проводят в световом (при радиоактивной или биотинилирован-ной метке) или флюоресцентном (при мечении флюорохрома-ми) микроскопе. Гибридизационный сигнал представляет собой скопление зерен при использовании радиоактивной метки или окрашенный осадок, локализованный в цитоплазме, ядре или перинуклеарной области в случае биотинилированных зондов с хромогенной или флюорохромной меткой. Интенсивность окрашивания можно использовать в качестве примерной оценки
количественного содержания изучаемой нуклеиновой кислоты-мишени в препарате. Высокая плотность и интенсивность сигнала говорят о наличии от нескольких сотен до тысячи и более копий искомой последовательности. Для количественной оценки (подсчета сигналов)
возможно использование денситометрии с помощью автоматических анализаторов изображения.
Таким образом, сфера применения метода гибридизации in situ постоянно расширяется, и из чисто научного метода он все больше приходит в практику диагностических центров (рис. 2-6, см. цв. вклейку).
Полимеразная цепная реакция
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - один из методов молекулярной биологии, широко применяемый в клинической практике. Полимеразная цепная реакция впервые была осуществлена в 1985 г. на фирме Cetus. Последующее использование в ПЦР термостабильной ДНК-полимеразы существенно расширило возможности ее применения и в научных исследованиях, и в клинической практике. Главное достоинство этого метода - возможность выявления при ПЦР единственной уникальной нуклеотидной последовательности, в то время как метод гибридизации требует, чтобы мишень присутствовала в образце в нескольких десятках копий.
ПЦР представляет собой специфическую амплификацию нуклеиновых кислот, осуществляемую in vitro, инициируемую синтетическими нуклеотидными праймерами. ПЦРцикл состоит из тепловой денатурации ДНК, ее отжига с праймером и удлинения цепи (элонгации). Смена этих этапов происходит в результате простого изменения температуры. Праймеры при этом ориентируются на матрице так, что с каждым циклом репликации экспоненциально увеличивается число копий специфической нуклеотидной последовательности. Для выявления уникальной последовательности в реакционную смесь добавляют специфические праймеры в избыточном количестве. Поскольку праймеры гибридизуются с обеими цепями ДНК, исходная последовательность и синтезируемые ПЦРпродукты могут служить матрицами в последующих раундах репликации. Благодаря этому уникальная последовательность, присутствующая в клиническом образце в минимальном количестве (1 или 2 копии), многократно умножается. Чувствительность метода ПЦР уникальна - ПЦР позволяет найти одну аномальную последовательность на 100 000-1 000 000 нормальных клеток. С помощью ПЦР можно амплифицировать и РНК, предварительно
Данная книга в списке рекомендаций к покупке и прочтению форума сайта https://meduniver.com/
получив ее ДНК-копию. Поскольку РНК менее стабильная молекула, чем ДНК, ее выявление требует более сложных методических приемов. Перед проведением ПЦР проводится пробоподготовка: выделение ДНК (или РНК) из опухолевой ткани, замороженных образцов или фиксированных формалином и залитых в парафин тканей. Молекула ДНК - очень устойчивая биологическая структура, и ДНК можно выделять
из парафиновых блоков 30-летней давности. Перед выделением ДНК морфологу необходимо оценить количество опухолевых клеток на гистологическом препарате соответствующего парафинового блока. Желательно, чтобы количество опухолевых клеток (точнее, ДНКсодержащих ядер) составляло не менее 70% всех клеток данного препарата. В случаях, когда опухолевый материал представлен в количестве менее 50%, необходимо проведение лазерной микродиссекции. Для визуализации результатов ПЦР используют метод электрофореза.
В практической диагностике метод ПЦР применяют для выявления в клинических образцах вирусов, микобактерий, простейших, бактерий, для обнаружения врожденных и приобретенных генетических нарушений, идентификации личности и т.д. В диагностике онкологических заболеваний ПЦР позволяет выявлять генетические изменения, специфичные для определенных опухолей. Этот метод помогает поставить точный диагноз в случаях, когда другие методы недостаточно информативны и необходимо определение чувствительности к ряду таргетных препаратов. Для определения точной локализации ДНКили РНКпоследовательности в морфологической структуре используют объединение ПЦР и ГИС - ПЦР in situ (рис. 2-7, см. цв. вклейку).
Глава 3. Лучевые методы диагностики в онкологии
Лучевая диагностика стремительно развивается и совершенствуется. Использование вычислительной техники позволяет перейти от аналоговых изображений к цифровым, что повышает качество и количество информации. Появилась возможность сохранять, анализировать и передавать изображения в электронном виде, создавать электронные архивы, базы данных и телемедицинские сети.
Применяют следующие методы лучевой диагностики:
•классическую рентгенографию;
•мультиспиральную КТ;
•УЗИ;
•МРТ и радионуклидное исследование:
традиционное;
позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ).
Цель
Задачи лучевых методов в онкологической практике:
•первичная диагностика - выявление новообразований и определение их локализации;
•дифференциальная диагностика - уточнение этиологии патологических изменений
(доброкачественность или злокачественность новообразований);
•выявление стадий злокачественных опухолей - оценка местной распространенности процесса, обнаружение регионарных и отдаленных метастазов;
•интервенционная диагностика - пункция и биопсия новообразований под контролем лучевых методов для морфологической верификации процесса;
•топометрия - разметка для планирования объема различных видов лечения;
•оценка результатов лечения - уточнение степени регрессии опухолей, радикальности хирургического лечения, выявления рецидивов заболевания, оценка жизнеспособности трансплантированных лоскутов;
•лечебные манипуляции - лечение неопластических процессов под контролем лучевых методов исследования.
Долгие годы в лучевой диагностике доминировал принцип последовательного перехода от простой методики исследования к более сложным методам. Сейчас чаще применяют наиболее результативные, в том числе дорогостоящие методы или их сочетание, чтобы получить в максимально короткие сроки информативные данные.
Внедрение в практику мультиспиральной КТ, МРТ и ПЭТ существенно изменяет тактику обследования пациентов при поражении различных органов и систем, а в некоторых ситуациях исключает из диагностического алгоритма ряд методик рентгенологического, радионуклидного исследования и УЗИ, так как только с их помощью можно получить информацию, которая невозможна при других способах исследования.
Мультиспиральная КТ, МРТ и ПЭТ, как и другие методы исследования, имеют свои разрешающие возможности и ограничения, их диагностическая эффективность вариабельна для решения различных задач.
Данная книга в списке рекомендаций к покупке и прочтению форума сайта https://meduniver.com/
3.1. УЛЬТРАЗВУКОВАЯ ДИАГНОСТИКА ОПУХОЛЕЙ ОСНОВНЫХ ЛОКАЛИЗАЦИЙ
Одним из ведущих диагностических методов первичной и уточняющей диагностики в онкологии считают ультразвуковую диагностику. Преимущества ультразвукового исследования:
•достоверность получаемых результатов;
•неинвазивность;
•доступность;
•безопасность;
•отсутствие ионизирующего излучения;
•возможность неоднократного применения;
•простота и дешевизна исследования;
•возможность его использования для планирования объема хирургического и консервативного лечения, выявления рецидива заболевания и осложнений терапии.
Исследование проводят как через кожные покровы, так и с применением полостных датчиков (эндовагинального, эндоректаль-ного, чреспищеводного). Широко применяют интраоперационное ультразвуковое исследование, позволяющее эффективно проводить ревизию и выявлять метастазы опухоли, не выявленные на дооперационном этапе. Принцип ультразвковой диагностики основан на акустическом сопротивлении исследуемых тканей. Чем оно выше (например, у костных структур или жировой ткани), тем интенсивнее отражение ультразвуковых волн и тем светлее исследуемый участок выглядит на сканограмме. Наименьшим сопротивлением обладает жидкость, которая выглядит на сканограммах темной.
Задачи ультразвуковой диагностики в онкологии
При обследовании больных с онкологическими заболеваниями врач, выполняющий УЗИ, решает следующие задачи:
•выявляет наличие патологического процесса (первичная диагностика);
•выявляет исходную локализацию процесса (первичная диагностика);
•определяет характер процесса: опухоль или не опухоль (дифференциальная диагностика);
•определяет морфологическую природу опухоли (первичная и дифференциальная диагностика, морфологическая верификация);
•выявляет местную распространенность опухоли (уточняющая диагностика - определение категории T по классификации TNM);
•выявляет метастатическое поражение лимфатических узлов (уточняющая диагностика - определение категории N по классификации TNM);
•выявляет отдаленные метастазы (уточняющая диагностика - определение категории M по классификации TNM);
•выявляет жидкость в серозных полостях;
•диагностирует осложнения опухолевого процесса;
•выявляет сопутствующие заболевания, уточняет их стадию, влияние на течение процесса и возможность лечения, возможное влияние на подготовку к операции и течение послеоперационного периода;
•определяет динамику опухолевого процесса во время и после лечения.
•позволяет исключить опухолевый и банальный тромбоз.
Отдельно следует остановиться на диагностических манипуляциях, относящихся к планированию и/или выполнению лечебных воздействий.
•Малоинвазивные лечебные манипуляции под лучевым контролем.
•Интраоперационная диагностика (в том числе внутрипо-лостное исследование).
•Разметка опухоли перед операцией, лучевой терапией.
Подготовка
С внедрением в клиническую практику ультразвуковых методов появилась возможность видеть органы брюшной полости и забрюшинного пространства. Исследование проводят натощак и после проведения профилактики метеоризма, при необходимости - после очистительной клизмы накануне исследования.
Методика и последующий уход
Наполненный мочевой пузырь (300-400 мл мочи) - хорошее акустическое окно для осмотра органов малого таза. Исследова-
ние мочевого пузыря осуществляют через переднюю брюшную стенку и трансвагинально (трансректально). При исследовании врач оценивает состояние стенки, внутренний контур, наличие опухоли, ее форму, локализацию, характер роста, наличие инфильтрации слизистой оболочки, подслизистого и мышечного слоев, выход за пределы органа, вовлечение околопузырной клетчатки, соседних органов и тканей (рис. 3-1).
Данная книга в списке рекомендаций к покупке и прочтению форума сайта https://meduniver.com/
Рис. 3-1. Злокачественное новообразование мочевого пузыря, трансабдоминальное УЗИ при наполненном мочевом пузыре. Большая стелющаяся опухоль с инвазией всех слоев, виден экстрапузырный компонент опухоли
Умужчин после осмотра мочевого пузыря проводят трансабдоминальное и трансректальное УЗИ простаты. Оценивают размер железы, форму, контуры, структуру, наличие узловых образований, а при их обнаружении - выход узлового образования за пределы органа или инфильтрацию окружающей клетчатки и прорастание в смежные органы. При выявлении типичной картины опухоли в виде гипоэхогенной зоны в периферической зоне железы, часто с неровным контуром, диагноз не представляет сложностей. Во всех случаях выявления очаговых образований простаты, особенно при повышении уровня ПСА, показана мультифокальная биопсия под контролем УЗИ.
Уженщин УЗИ органов малого таза проводят в два этапа: первоначально - через брюшную стенку с наполненным мочевым пузырем, затем - уточняющее трансвагинальное исследование.
При злокачественном новообразовании шейки матки УЗИ помогает решить следующие задачи:
•установить тип роста опухоли (экзофитный или эндофит-ный);
•определить глубину инвазии опухоли в толщу стенки шейки матки и переход опухоли на тело матки;
•выявить инфильтрацию стенок влагалища и параметраль-ных зон;
•оценить вовлечение мочевого пузыря и толстой кишки; выявить метастазы в подвздошных лимфатических узлах и яичниках.
Опухоли шейки матки небольших размеров могут иметь повышенную или пониженную эхогенность. Опухоли больших размеров гипоэхогенные, размеры шейки матки увеличены, наружный контур при этом нечеткий, неровный, опухоль может вовлекать тело матки. С одной или с двух сторон от шейки матки возможно выявление инфильтратов. Эхогенность инфильтратов понижена или повышена, важно выявить переход опухоли на стенки мочевого пузыря, прямой кишки, мочеточники.
При раке матки УЗИ помогает решить четыре основные задачи:
•определить точную локализацию опухоли в полости матки;
•выяснить глубину инвазивного роста опухоли в мио-метрий;
•уточнить наличие поражения внутреннего маточного зева;
•определить метастатическое поражение лимфатических узлов и яичников.
При злокачественном новообразовании яичников УЗИ помогает ответить на следующие вопросы:
•один или оба яичника поражает опухоль;
•есть ли инфильтрация брюшины малого таза, асцит, метастазы в печени и лимфатических узлах парааортальной области, поражение большого сальника и диссеминация по брюшине.
Для злокачественных новообразований яичников характерны смешанное внутреннее строение, наличие перегородок, уплотнений, нечеткость контуров, асцит. Эхография имеет высокую точность при выявлении асцита. В отличие от скопления в брюшной полости жидкости другого происхождения, петли кишечника, обычно свободно плавающие в асцитической жидкости, при злокачественном новообразовании яичников склеиваются в области брыжейки и приобретают форму атомного гриба. Карциноматоз большого сальника определяется как большое уплощенное гипо-или гиперэхогенное образование, расположенное непосредственно под передней брюшной стенкой.
Эхография - основной метод оценки строения щитовидной железы. Исследование выполняют линейным датчиком с частотой с 7,5-10,0 МГц. При выявлении очагов в щитовидной железе оценивают их количество, структуру (кисты или кистозные новообразования, тканевые новообразования), форму, контур. Если опухоль неправильной формы, с неровным контуром, выходит за пределы железы, можно заподозрить злокачественный характер процесса. Нередко злокачественное новообразование щитовидной железы имеет правильную овальную или округлую форму, ровные контуры. У больных с очагами в щитовидной же-
лезе необходимо проводить УЗИ зон регионарного лимфооттока (по ходу сосудистонервных пучков шеи) и верхнего средостения выше дуги аорты.
В диагностике злокачественного новообразования молочной железы УЗИ занимает важное место. Исследование проводят линейным датчиком с частотой 7,5-10,0 МГц. Эхография предпочтительна для пациенток до 40 лет. После 40 лет, особенно при наличии жировой инволюции, исследование начинают с маммографии. Для злокачественного новообразования молочной железы характерны округлая или неправильная форма, неровные, нередко нечеткие контуры, гипоэхогенная структура, пониженная звукопроводимость. За опухолью часто видна эхотень. Опухоль может инфильтрировать кожу и грудные мышцы. При отечной форме рака узел часто не виден, заметны только повышение эхо-генности всех структур железы, нечеткость их контуров, утолщение кожи, иногда значительное.
При злокачественном новообразовании легкого УЗИ используют для обнаружения метастазов в печени, надпочечниках (рис. 3-2), почках, поджелудочной железе, надключичных лимфатических узлах. УЗИ позволяет выявить жидкость в полости перикарда и в плевральных полостях.
Данная книга в списке рекомендаций к покупке и прочтению форума сайта https://meduniver.com/
Рис. 3-2. Метастаз злокачественного новообразования легкого в правом надпочечнике. Kidney - правая почка, Liver - печень, Suprarenal Gland - массивный опухолевый узел в правом надпочечнике
При злокачественном новообразовании желудка УЗИ используют для выявления метастазов в печени, в регионарных и надключичных лимфатических узлах, жидкости в брюшной полости, а у женщин - метастазов в яичниках. Кроме выявления метастазов, при УЗИ можно осмотреть и опухоль, уточнить ее протяженность и глубину инвазии, выявить переход опухоли на пищевод.
Особенно эффективна для определения глубины инвазии опухоли желудка эндосонография (чреспищеводное УЗИ).
При злокачественном новообразовании ободочной и прямой кишки (рис. 3-3) принципы УЗИ те же, что и при злокачественном новообразовании желудка, только лимфатические узлы в первую очередь ищут возле пораженной кишки и в брыжейке кишечника, далее - в паракавальных и парааортальных областях, при наличии пораженных узлов в забрюшинном пространстве - в надключичных областях. Симптом пораженного полого органа виден в области пораженного отдела кишки. Можно определить глубину инвазии опухоли и врастание ее в соседние органы и структуры.
Рис. 3-3. Злокачественное новообразование прямой кишки, трансвагинальное УЗИ. Инфильтрация всех слоев стенки кишки, массивный выход опухоли в парарек-тальную клетчатку
При опухолях почек метод позволяет осмотреть опухоль, определить выход ее за капсулу почки. Минимальные размеры опухоли в почке, при которых ее удается визуализировать, - 1015 мм (при выходе опухоли за контур почки). Кроме самой опухоли почки удается осмотреть почечные сосуды и нижнюю полую вену и определить наличие в почечной и нижней полой вене опухолевого тромба (рис. 3-4). Выполняют УЗИ забрюшинных лимфатических узлов и печени.
При опухолях яичек производят осмотр яичка, паховых, подвздошных, парааортальных лимфатических узлов, при выявлении их поражения - надключичных узлов. При небольших размерах первичной опухоли у этих больных нередко выявляют массивные конгломераты пораженных лимфатических узлов в указанных областях. При обнаружении массивных конгломератов лимфатических узлов в забрюшинном пространстве (а иногда и в над-
Данная книга в списке рекомендаций к покупке и прочтению форума сайта https://meduniver.com/
Рис. 3-4. Ретропеченочный (внутрипеченочный) тромбоз нижней полой вены при злокачественном новообразовании почки. Тромб большого диаметра растягивает нижнюю полую вену
ключичных областях), особенно у молодых мужчин, необходимо выполнить УЗИ яичек.
Анализируя данные по использованию УЗИ в диагностике опухолей человека, необходимо отметить, что в онкологии метод занял достойное место среди традиционных диагностических методов исследований.
Инвазивная сонография
Инвазивная сонография - диагностические и лечебные манипуляции, связанные с проникновением в органы и ткани человека и выполняемые под контролем УЗИ. Все диагностические пункции принципиально выполняют по двум методикам - методу свободной руки и с помощью адаптера, задающего фиксированное направление пункционной игле.
•Первую методику применяют у больных с патологическими изменениями, локализующимися в поверхностных органах и тканях, т.е. в щитовидной, молочной железе, периферических лимфатических узлах, и с опухолями мягких тканей. Для получения материала используют инъекционный шприц. Ультразвуковой контроль манипуляции позволяет получать материал прицельно из любого участка патологического образования. Данная методика позволяет получать материал путем аспирации для цитологического морфологического исследования.
•Вторая методика пункции - использование биопсий-ного пистолета и пункционного адаптера - эффективна при пункции патологических очагов в глубоко расположен-