2 курс / Нормальная физиология / Молекулярные_и_физиологические_механизмы_старения_в_2_т_,_Т_2_Анисимов

V. N. ANISIMOV

MOLECULAR

AND PHYSIOLOGICAL

MECHANISMS

OF AGING

St. PETERSBURG «NAUKA»

2008

В.Н. Анисимов

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ СТАРЕНИЯ

Издание второе, дополненное

Санкт-Петербург «НАУКА» 2008

В. Н. Анисимов

6

à ë à â à 12

МУТАНТНЫE И ТРАНСГЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ

ÂИЗУЧЕНИИ МЕХАНИЗМОВ СТАРЕНИЯ

ÈВОЗРАСТНОЙ ПАТОЛОГИИ

Когда душе и торопкой и робкой Предстанет вдруг событий глубина, Она бежит виющеюся тропкой, Но смерти ей тропинка не ясна.

Осип Мандельштам

12.1. ВВЕДЕНИЕ

Различия между линиями мышей по продолжительности жизни и патологии, включая рак, свидетельствуют о важной роли генов как детерминант этих параметров, хотя существуют доказательства участия в этом и эпигенетических механизмов, таких как импринтинг. Известны гены, которые определяют вариации в продолжительности жизни генетически родственных линий (de Haan et al., 1998). Эти гены имеют высокий порог чувствительности и определяют генетическую стабильность линии животных (Jazwinski, 1999). В течение последних десяти лет создан ряд генетических моделей животных с увеличенной или уменьшенной продолжительностью жизни. Описаны трансгенные модели увеличения продолжительности жизни нематод и плодовых мух (Tower, 2000). В экспериментальную геронтологию стали внедряться модели млекопитающих, прежде всего мышей, со спонтанными и индуцированными мутациями, гомозиготные нокаутные и трансгенные модели (Andersen, 2001; Anisimov, 2001, 2003). Следует под- черкнуть, что, хотя эффекты некоторых генетических модификаций проявляются лишь в определенные периоды развития особи, они могут проявляться и в течение всей жизни животного. Имеется довольно много существенных ограничений при интерпретации данных, полученных в опытах с использованием трансгенных животных (Jazwinski, 1999). С одной стороны, «выключение» специфической функции какого-либо гена может привести к ошибочному заключению о его функции, поскольку компенсаторные механизмы организма могут значительно изменить физиологию животного. С другой стороны, суперэкспрессия гена может не оказать никакого влияния на продолжительность жизни или параметры старения животного. Jazwinski (1999) заметил, что при суперэкспрессии трансгенов, вероятнее всего, будет происходить их взаимодействие с другими генами и с окружающей средой, как внешней, так и внутренней.

Вопрос о взаимоотношениях между процессами старения и канцерогенеза интенсивно обсуждается в течение многих лет (cм. главу 11). Зависимость частоты развития злокачественных новообразований от возраста рассматривается в соответствии с предположением, что для канцерогенеза не-

7

В. Н. Анисимов

обходимы множественные генетические изменения. Хотя достижения молекулярной биологии во многом способствовали выявлению многих сторон взаимоотношений между канцерогенезом и старением, все еще неясно, являются ли генетические маркеры общими для всех типов рака и какие из них ассоциированы с возрастным увеличением частоты рака. Трансгенные технологии позволили создать модели, позволяющие изучать отдельные звенья процессов, ведущих к потере контроля за клеточным циклом и развитию опухолей. Трансгенные модели весьма удобны для обнаружения и изучения канцерогенных и химических агентов (Alexander, 2000). Трансгенные и нокаутные мышиные модели, характеризующиеся укороченной или увеличенной продолжительностью жизни, дают уникальную возможность оценить роль генов, вовлеченных в процесс старения, в механизмах развития возрастной патологии, включая рак.

Однако нужно отдавать себе отчет в том, что в организме гены находятся в сети сложных взаимодействий и при получении нокаутированных животных однозначная информация о функции исследуемого гена получается сравнительно редко. Один и тот же ген, инактивированный у животных разных линий, может приводить к разным фенотипическим эффектам из-за отличий в геномной структуре разных линий.

12.2. МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ

Трансгенные животные — это животные, несущие фрагмент чужеродной ДНК, устойчиво интегрированный в геном организма, или имеющие часть удаленного или видоизмененного генома. При этом полученные генетические изменения устойчиво передаются потомкам. Первое сообщение, описывающее методику получения трансгенных мышей, было опубликовано в 1980 г. (Turrens, Boveris, 1996). В последние годы трансгенные мыши широко используются для изучения различных биомедицинских проблем (Anisimov, 2003; Transgenic Animal..., 2006). Существует два основных экспериментальных подхода, в рамках которых трансгенные мыши могут быть использованы для изучения старения: 1) приобретение функции è 2) уменьшение или потеря функции.

Трансгенных мышей обычно получают с помощью трех методических приемов. Наиболее простой и широко используемый — метод микроинъекции экзогенной ДНК в оплодотворенную яйцеклетку. Оплодотворенная яйцеклетка перемещается к маточной трубе псевдобеременных самок и развивается в ней. Интродукция экзогенной ДНК в геном оплодотворенной яйцеклетки, как полагают, происходит при обычном процессе расщепления и репарации хромосом, происходящем в геноме случайным образом. При этом методе создания трансгенных мышей важно, чтобы, несмотря на слу- чайный характер процесса интеграции, экзогенная ДНК была интегрирована в геном всех клеток в организме, особенно половых клеток. Когда инте-

8

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

грирование происходит на более поздних стадиях эмбрионального развития, получают мозаичных животных, в которых экзогенная ДНК определяет специфичность развития отдельных клеточных образований или клеточных пулов.

Трансгенные мыши также могут быть получены инфицированием на ранней стадии эмбрионов рекомбинантным ретровирусным геном. Этот метод имеет преимущество только в том случае, когда одна копия провируса проявляется при хромосомной интеграции сайтов. Эта методика имеет несколько ограничений. Например, ретровирус не может равномерно инфицировать все клетки на ранних стадиях развития эмбрионов, поэтому частота трансфекции вируса относительно низка. Кроме того, экспрессия генов, введенных в ретровирусный вектор, довольно низка, и только относительно малый фрагмент ДНК (меньше 10 тысяч пар оснований) может быть клонирован в ретровирусный вектор.

Третий метод для получения трансгенных мышей имеет ряд преимуществ благодаря плюрипотентности эмбриональных клеток линии ES. При этом клетки ES в культуре модифицируются с помощью обычного метода введения гена и модифицированные клетки повторно вводятся в ранние бластоцисты, которые пересаживаются псевдобеременным самкам. Модифицированные ES клетки способствуют развитию химерного потомства; можно получить химерных мышей, в которых клетки ES вносят вклад в зародышевую линию. Этот метод позволяет исследователю отбирать in vitro желательный генотип или фенотип ES клеток. Указанный метод используется преимущественно для получения трансгенных конструкций, несущих мутацию в специфичном гене. Эти мутации могут инактивировать ген или изменять функцию белка. Метод имеет некоторые преимущества при сравнении с другими, хотя следует отметить, что получение культуры клеток и обеспечение полной плюрипотентности ES клеток технически довольно сложно.

12.3. ВЫБОР ЛИНИИ МЫШЕЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Вопрос о выборе линии мышей для выведения трансгенных животных, используемых в исследовании старения, обсуждался многими авторами (Andersen, 2001; Transgenic Animal..., 2006). Различные гибридные и инбредные линии использовались для получения трансгенных мышей методом микроинъекции (Hogan et al., 1994). Наиболее часто ДНК вводили второму поколению (F2) гибридной зиготы, полученной при скрещивании самок гибридов первого поколения (F1) и самцов гибридов F1 мышей (например, C57BL/6 SJL; C57BL/6 DBA; C57BL/6 СЗН/Не, или BALB/с C57BL/6). Полученные мыши F2 были скрещены с потомками второго поколения для получения третьего поколения (F3). Затем трансгенная линия мышей выводилась путем скрещивания гибридных потомков, дающих поколения F4, F5,

9

В. Н. Анисимов

F6, и т. д. Из-за постоянных рекомбинаций от мыши к мыши, от поколения к поколению генетическое изменение будет значительно. Другими словами, никакая мышь не будет генетически сходна с любой другой мышью. Эти генетические отклонения создают главную проблему для изучения старения из-за трудности в поддержании наследственно устойчивой колонии гибридных мышей. Например, непрерывное размножение F2, F3, F4 и последующих поколений мышей привело бы к генетическому изменению и незапланированной селекции (по жизнеспособности, плодовитости и т. д.). Поэтому весьма вероятно, что продолжительность жизни и патологические характеристики любой колонии гибридных мышей значительно изменятся со временем. Это ограничивает использование колоний гибридных мышей для исследования старения, так как практически не удастся получить колонию животных с идентичным генотипом. Проблема поддержания наследственно устойчивой колонии гибридных мышей может быть частично решена регулируемым размножением трансгенных животных и генерацией поколения F1 при скрещивании с родительской линией нетрансгенных мышей. Такая стратегия размножения обеспечивает гетерозиготность колонии трансгенных мышей. Даже если исследователь получает гомозиготных трансгенных мышей, впоследствии в колонии все равно произойдет генетический дрейф и селекция.

Проблемы генетической модификации животных и генетического дрейфа/селекции могут быть минимизированы при использовании инбредных линий мышей для получения трансгенных животных. Хотя такие инбредные трансгенные мыши были получены (например, на линиях C57BL/6, FVB/N, BALB/c, и C3H) (Hogan et al., 1994), эффективность получения трансгенных мышей в инбредных линиях относительно низка. Например, R. L. Brinster и соавт. (1985) сообщили, что эффективность получения трансгенных мышей на линии C57BL/6 была в восемь раз ниже по сравнению с линией (C57BL/6 SJL) — 3.3 % по сравнению с 27.1 %. Отмечены подобные различия и в эффективности получения трансгенных мышей на инбредных линиях C57BL/6 и СЗНеВ/Fe по сравнению с первым поколением гибридов BALB/c C57BL/6 и C57BL/6 DBA2. Таким образом, первона- чальные затраты и время, требуемое для получения трансгенных мышей инбредных линий, намного больше, чем для гибридных мышей. Однако инбредные линии мышей, имеющие соответствующие элементы в гене (промотор/активатор), более приемлемы для экспрессии трансгена, чем гибридные мыши. Наиболее важно то, что в этом случае не нужно поддерживать наследственную устойчивость в колониях мышей. При исследовании старения к наиболее широко используемым для получения трансгенных животных относятся такие инбредные линии мышей, как C57BL/6, DBA/2, CBA/Ca, и BALB/с. Сведений о выживаемости и патологических процессах, которые развиваются при старении у мышей этих четырех инбредных линий, достаточно много (Masoro, 1991). Напротив, нет данных по выживаемости и патологическим процессам в колониях гибридных мышей, поддерживаемых путем непрерывного скрещивания гибридов, и такие ко-

10