2 курс / Нормальная физиология / Молекулярные_и_физиологические_механизмы_старения_в_2_т_,_Т_2_Анисимов

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

guchi и соавт. (2007), позволяет мозгу старых животных избегать неблагоприятного эффекта гиперинсулинемии, приводя к избытку веса тела и увеличению продолжительности жизни. Как полагают авторы, умеренные физические упражнения, ограничение калорийности питания и снижение веса, т. е. воздействия, снижающие уровень циркулирующего инсулина, могут увеличивать продолжительность жизни, ослабляя действие инсулина в головном мозге.

Нокаут гена, кодирующего белок, ассоциированный с беременностью (PAPP-A), особой металлопротеиназы, функция которой вне беременности заключается в деградации IGF-1-связывающего белка и повышении биодоступности IGF-1 без увеличения его экспрессии, приводил к увеличению средней и максимальной продолжительности жизни на 30—40 % (Сonover, Bale, 2007). При этом не отмечалось снижения потребления корма или ка- ких-либо нарушений в эндокринной системе. Более того, у PAPP-A-нокаутных мышей была существенно снижена частота развития спонтанных опухолей.

12.5.4. Мыши C/EBP с генетически обусловленным снижением липогенеза

С целью выяснения роли жировой ткани в долголетии и влияния диеты на продолжительность жизни были получены генетически модифицированные мыши, у которых ген С/EBPa, участвующий в регуляции липогенеза, был заменен на ген С/EBPb, что приводило к предотвращению накопления жира в белой жировой ткани (Сhiu et al., 2004). Оказалось, что мыши с двумя аллелями С/EBPb (мыши b/b) жили на 5.2 месяца дольше, чем мыши-ге- терозиготы с аллелями a/b (28.9 и 23.7 месяца соответственно). Хотя мыши b/b потребляли больше корма, их локомоторная активность была одинакова с контролем, но температура тела была на 0.3—0.5 °C выше. Гомозиготы потребляли больше кислорода и продуцировали больше углекислого газа, чем гетерозиготы, что свидетельствовало о том, что мыши b/b тратили больше энергии, чем мыши a/b. В жировой ткани мутантных мышей были обнаружены более метаболически активные, термогенные митохондрии, обеспечивающие сгорание энергии. Сведения о частоте ассоциированной с возрастом патологии у этих мышей отсутствуют.

12.5.5.Мыши с нокаутированным геном ð21

Âработе A. R. Choudhury и соавт. (2007) неожиданно было показано, что делеция белка р21, являющегося эффектором супрессорного белка р53, приводит к увеличению продолжительности жизни и потере стволовыми клетками функции у мышей с дисфункцией теломер, но при этом не наблюдается увеличения хромосомной нестабильности и частоты развития опухолей.

61

В. Н. Анисимов

Убедительные доказательства, полученные на различных системах, позволяют предположить, что дисфункция теломер является критическим, подавляющим опухоли, механизмом у человека (Maser, DePinho, 2002). В отсутствие теломеразной активности постоянная пролиферация приводит к укорочению теломер и дисфункции, которая в свою очередь вызывает репликативное старение. В большинстве опухолей человека проблема укороче- ния теломер решается реактивацией теломеразной активности. Накапливаются данные о том, что дисфункция теломер также участвует в старении. Например, у генетически модифицированных мышей с укороченными теломерами имеет место ускоренное старение (Rudolph et al., 1999). Доказательства дисфункции теломер были получены в коже приматов во время физиологического старения (Herbig et al., 2006). У людей с мутациями, которые нарушают теломеразный РНК-белковый голоферментный комплекс, развивается преждевременная недостаточность костного мозга и укорачивается продолжительность жизни (Yamaguchi et al., 2005). Эта двойная роль в предотвращении рака и старения делает обуcловленное теломеразой репликативное старение важнейшим компонентном гипотезы «старение—рак» (Bell, Sharpless, 2007).

Опухолевый супрессор р53 является главным детерминантом ответа организма на дисфункцию теломер. Было показано, что теломерная дисфункция в манере, свойственной двойным разрывам нитей ДНК, cовместно с активацией р53 приводит либо к старению, либо к апоптозу (Maser, DePinho, 2002). В соответствии с этой моделью при дефиците р53 не развиваются многие фенотипические последствия теломерной дисфункции, такие как нарушение фертильности и апоптоз герминативных клеток у мышей с патологически укороченными теломерами (Chin et al., 1999). Несмотря на впе- чатляющий фенотипический эффект дисфункции теломер, животные с короткой теломерой, у которых также отсутствует р53, не живут дольше, чем животные с короткими теломерами и интактным р53. Напротив, такие р53-дефицитные мыши с укороченными теломерами очень подвержены развитию опухолей, что позволяет рассматривать развитие либо старения, либо рака как результат теломерной дисфункции, зависящей от р53 функции.

Исходя из этих данных, Choudhury с соавт. (2007) исследовал влияние дефицита р21 у мышей с дисфункцией теломер. р21 является ингибитором циклин-зависимых киназ, которые транскрипционно активируют р53 для индукции остановки клеточного цикла. Хотя способность белка р53 индуцировать клеточное старение кажется критически важной для его опухолевосупрессорной активности, имеется достаточно аргументов в пользу предположения, что р21 не является критическим эффектором супрессорного действия р53 на опухоли. Например, немногие, если вообще какие-либо генетические повреждения специфически и воспроизводимо происходят именно в р21 в злокачественных опухолях человека, тогда как мыши с наследуемым дефицитом р21 только в весьма умеренной степени подвержены развитию опухолей. Кроме того, сообщалось (Wang et al., 1997), что насле-

62

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

дуемая недостаточность р21 увеличивает чувствительность к ионизирующей радиации, но замедляет начало рака. В соответствии с этой работой Choudhury и соавт. (2007) показали, что в противоположность дефициту р53 инактивация р21 у животных с дисфункцией теломер существенно увеличи- вает продолжительность жизни. Вместе взятые, эти результаты позволяют предполагать, что принципиальная роль р21 состоит не в супрессии опухолей, а скорее в эволюционно старейшей задаче р53: опосредование клеточ- ного ответа на повреждение ДНК и других тканей. К удивлению, эта активность р53 через р21, кажется, промотирует старение в ответ на постоянный сигнал, который происходит от дисфункции теломер.

12.5.6. Мыши с нокаутированным геном ð66 shc

Адапторный ген, кодирующий белок р66shc, фосфорилируется по тирозину в ответ на активацию рецепторов фактора роста и образует стабильные комплексы с Grb2– адапторным белком для ras-зависимого SOS-факто- ра. Тем не менее он не влияет на активность митоген-активируемой протеинкиназы (МАРК) и подавляет активацию промотора c-fos. Белок р66shc представляет собой вариант соединенных белков р52shc è ð46shc и является цитоплазматическим сигнальным трансдуктором в процессе передачи митогенных сигналов от активированных рецепторов к Ras. Направленная мутация гена ð66shc у мышей привела к развитию устойчивости к вызванному паракватом окислительному стрессу, индуцирующему продукцию анионов супероксида, и увеличению продолжительности жизни животных на 30 % (Migliaccio et al., 1999). У ð66shñ–/– мышей выявлено снижение системного и тканевого окислительного стресса, атерогенеза и апоптоза в эндотелии аорты (Napoli et al., 2003). Средняя продолжительность жизни гомозиготных по ð66shc–/– мышей составила 973 37.3 дня, тогда как у мышей дикого типа 761 19.0 дней (+ 28%) и у гетерозиготных мышей р66shc+/– 815 37.5 дня (+19 %). После достижения возраста 28 месяцев, когда все 14 животных дикого типа умерли, 3 из 8 гетерозиготных (37 %) и 11 из 15 гомозиготных мышей (73 %) продолжали жить. Не было обнаружено статистически достоверных различий по массе тела и потреблению корма между нокаутными и животными дикого типа. У мышей ð66shc–/– не было явных аномалий. Спонтанные опухоли были обнаружены у 4 из 134 мышей ð66shc–/– в течение первого года жизни (2.9 %), тогда как в контрольной группе мышей дикого типа, состоявшей из 211 животных, они были выявлены в 7 случаях (3.3 %) (Trinei et al., 2002). Более того, авторы сообщили, что не было выявлено различий в чувствительности ð66shc–/– и контрольных мышей к канцерогенному действию комбинации ДМБА и ТФА. Было также показано, что у мышей ð66shc–/– снижен уровень окислительных повреждений как в ядерной, так и в митохондриальной ДНК в легких, печени, селезенке, коже, почках и скелетных мышцах, но не в мозге или сердце, что соответствовало органным различиям в экспрессии этого гена (Trinei et al., 2002).

63

В. Н. Анисимов

Предполагается, что р66shc вовлечен в феноптоз, т. е. запрограммированную гибель организма, обусловленную массовым апоптозом в жизненно важных органах в результате воздействия активных форм кислорода (Skulachev, 2000). Полагают, что активные формы кислорода вызывают окисление фосфотидил-серина внутреннего слоя клеточной плазматической мембраны и приводят к появлению этого фосфолипида на наружном слое мембраны, что распознается специальным рецептором и вызывает фосфорилирование серинового остатка р66shc. Фосфорилированный по серину р66shc блокирует митоз и запускает апоптоз. Массовый апоптоз приводит к феноптозу и, следовательно, к сокращению продолжительности жизни организма. Представляется весьма важным то обстоятельство, что р53 вовле- чен в реализацию влияния АФК на р66shc и, напротив, стимулирует продукцию АФК при реализации феноптоза (Skulachev, 2002).

Недавно были получены новые экспериментальные подтверждения ключевой роли митохондрий в сигнальных путях, контролирующих долголетие и клеточную смерть. Так, было установлено, что сигнальный белок p66shc участвует в раннем ответе митохондрий мышиных фибробластов на оксидативный стресс (Н2Î2), включающий фрагментацию митохондрий и подавление прохождения сигнала Са2+ к митохондриям, с последующим апоптозом (Pinton et al., 2007). Авторы показали, что в этом процессе клю- чевую роль играет протеинкиназа С b, активация которой окислительным стрессом в клетке приводит к фосфорилированию р66shc и запускает накопление этого белка в митохондриях после их распознавания пропилизомеразой Pin1. Будучи однажды импортированным, р66shc вызывает нарушения ответа митохондрий на Са2+ и их трехмерную структуру, тем самым индуцируя апоптоз (Pinton et al., 2007; Hajnoczky, Hoek, 2007).

12.5.7.Трансгенные мыши

ñсуперэкспрессией гена Î6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы

Ген репарации ДНК О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза (MGMT) — суицидный акцепторный белок, удаляющий алкильную группу в О6 позиции гуанина, алкилированную канцерогенными нитрозосоединениями (Pegg, 2000). Было получено несколько линий мышей с избыточной экспрессией гена MGMT в мозге (150-кратное увеличение) и печени (25-кратное увеличение) (Walter et al., 1997). Авторы обнаружили, что суперэкспрессия гена MGMT в печени приводит к уменьшению частоты развития спонтанных гепатоцеллюлярных карцином у этих мышей по сравнению с диким типом (Walter et al., 1997). Поставлены специальные эксперименты по изуче- нию продолжительности жизни у этих мышей, поскольку есть основания полагать, что увеличение активности фермента MGMT приведет к увеличе- нию продолжительности жизни грызунов и снижению у них частоты развития спонтанных опухолей. Предварительные результаты этих опытов показали, что не наблюдается существенных различий в продолжительности

64

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

жизни и частоте развития спонтанных гепатом у трансгенных мышей, несущих этот ген, и мышей дикого типа (Walter et al.,1997). Однако окончательные результаты этого исследования еще не опубликованы.

Недавно другой группой были представлены доказательства увеличения продолжительности жизни и снижения частоты злокачественных новообразований у трансгенных мышей с суперэкспрессией гена MGMT, что свидетельствует о защитной роли этого гена в процессе злокачественной трансформации (Qin et al., 2000). Повышенная экспрессия этого гена в тимусе предотвращает индукцию лимфом N-нитрозометилмочевиной (НММ) (Allay et al., 1999), тогда как нокаутные MGMT–/– мыши более чувствительны к действию НММ и других алкилирующих агентов (Glassner et al., 1999).

12.5.8. Мыши с суперэкспрессией тиоредоксина

Трансгенные мыши, несущие копии гена тиоредоксина человека (TRX), небольшого редокс-активного белка, были сконструированы для изучения роли этого белка при стрессе (Mitsui et al., 2002). Было установлено, что клетки костного мозга TRX-трансгенных мышей более устойчивы к цитотоксическому действию ультрафиолетового облучения. У этих животных увеличивалась средняя и максимальная продолжительность жизни по сравнению с мышами дикого типа. При этом авторы не обнаружили развития какой-либо патологии у трансгенных мышей. У мышей, несущих избыточ- ные копии гена тиоредоксина 1 человека (TRX1), мозг значительно более устойчив к ишемическому повреждению, при этом у них снижен уровень карбонильных групп по сравнению с контролем дикого типа (Yoshida et al., 2006). Предварительные данные показали тенденцию к увеличению продолжительности жизни у TRX1 мышей. Однако число животных под наблюдением было слишком мало для надежных выводов.

12.5.9. Трансгенные мыши с суперэкспрессией гена каталазы

Для выяснения роли Н2Î2 в лимитировании продолжительности жизни млекопитающих были сконструированы мыши с суперэкспрессией каталазы в пероксисомах (PCAT), ядре (NCAT) или митохондриях (MCAT) (Schriner et al., 2005). Активность MCAT была увеличена в сердце, а также в скелетных мышцах и головном мозге трансгенных мышей по сравнению с соответствующими показателями в этих тканях у мышей дикого типа. При этом в сердце трансгенных мышей с дополнительными копиями гена каталазы в митохондриях ее активность превышала в 50 раз уровень у однопометных мышей дикого типа. За животными наблюдали до их естественной смерти.

Средняя продолжительность жизни двух групп мышей РСАТ увеличи- лась на 3—3.5 месяца (10—13 %) по сравнению с таковой у мышей дикого

65

В. Н. Анисимов

типа, на 1 и 3 месяца (4 и 11 %) в двух группах мышей NCAT и недостоверно отличалась от контроля. В двух группах мышей МСАТ средняя продолжительность жизни увеличилась соответственно на 4.5 месяца (17 %, p < 0.0001) и 5.5 месяцев (21 %, p < 0.0002). На 4.5 месяца была увеличена и средняя продолжительность жизни 10 % наиболее долгоживущих мышей в обеих группах МСАТ мышей. Различия в степени увеличения продолжительности жизни самцов и самок трансгенных мышей не обнаружено. Анализ кривых смертности показал параллельный сдвиг кривой для мышей МСАТ по сравнению с контролем, что свидетельствует, по мнению авторов, о замедлении начала старения у мышей с суперэкспрессией каталазы в митохондриях. Подчеркивается, что ни в одной группе трансгенных мышей не наблюдалось снижения веса тела или потребления корма по сравнению с соответствующим контролем. Сравнивали частоту развития патологических процессов у молодых (9—11 месяцев) и старых (20—25 месяцев) мышей МСАТ в сравнении с соответствующим контролем. В младшей возрастной группе существенных различий по сравнению с контролем не было выявлено. Однако у старых трансгенных МСАТ мышей было несколько меньше случаев лимфомы в селезенке (1 из 21), чем у старых мышей дикого типа (4 случая у 24 животных). Выраженность проявлений кардиомиопатии и артериосклероза была существенно меньшей у старых мышей МСАТ, чем в контроле. Также меньше у них были выражены проявления катаракты, снижена продукция АФК в сердце и образование 8-ОН-дезоксигуанозина в скелетных мышцах, что свидетельствует о защитном эффекте митохондриальной каталазы. Авторы полагают, что полученные ими результаты свидетельствуют о важной роли митохондриальных АФК, как факторов, лимитирующих продолжительность жизни млекопитающих. Интересно, что при конструировании мышей, гемизиготных по суперэкспрессии каталазы в пероксисомах (РСАТ) и гемизиготных по суперэкспрессии SOD1, средняя продолжительность их жизни была увеличена на 18.5 % по сравнению с мышами дикого типа и на 7 % больше, по сравнению с мышами РСАТ (p = 0.036), но при этом не наблюдалось увеличения максимальной продолжительности жизни (Schriner et al., 2005).

У мышей линии FVB сверхэкспрессия каталазы в сердечной мышце сопровождалась увеличением продолжительности жизни по сравнению с интактным контролем (Wu et al., 2007). В этой работе было показано, что избыточная экспрессия каталазы защищает сердечную мышцу от ассоциированных с возрастом модификаций белка и контрактильных дефектов. Кроме того, было отмечено, что после 15-месячного возраста смертность мышей с избыточной экспрессией каталазы снижалась, что проявлялось в сдвиге вправо кривой выживаемости по сравнению с кривой для мышей дикого типа и увеличении на 5 и 5.5 месяца средней и максимальной продолжительности жизни соответственно. У трансгенных самцов этой линии средняя продолжительность жизни была на 3 месяца увеличена по сравнению с контролем (30 и 27 месяцев cоответственно), а у самок — на 6 месяцев (33 и 27 месяцев соответственно) (Ren et al., 2007). Авторы не наблюдали

66

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

различий в весе тела, весе и размерах сердца, уровне глюкозы натощак у трансгенных мышей и мышей дикого типа.

У трансгенных мышей Tg(CAT)+/0 è Tg(CAT)+/+, несущих ген каталазы человека, избыточная экспрессия фермента (в 2 и 3—4 раза соответственно) наблюдалась во всех тканях, что сопровождалось увеличением резистентности гепатоцитов и фибробластов к вызывающему клеточную гибель действию перекиси водорода по сравнению с мышами дикого типа, но они были более чувствительны к действию параквата и TNFa (Chen et al., 2004). Фибробласты гомозиготных трансгенных мышей имели сниженную скорость роста in vitro и способность к колониеобразованию после g-облучения по сравнению с мышами дикого типа. Авторы не приводят данных о продолжительности жизни трансгенных мышей с избыточной экспрессией каталазы и задаются вопросом, почему клетки животных, продуцирующих избыток каталазы, более чувствительны к некоторым стрессирующим факторам? Одним из объяснений этого парадокса может быть, по их мнению, то обстоятельство, что избыточная экспрессия каталазы может разрывать сигнальную систему, в которой участвует перекись водорода.

12.5.10.Трансгенные мыши

ñсуперэкспрессией активатора урокиназы плазминогена

Мыши, несущие избыточные копии гена активатора урокиназы плазминогена (линия a-MUPA), характеризуются тем, что потребляют меньше корма (примерно на 20 %) и живут на 20 % дольше мышей дикого типа (Miskin, Masos, 1997). Ген a-MUPA вызывает синтез мРНК в мозге, кодирующий внеклеточный активатор урокиназы плазминогена. У этих мышей снижены вес и размеры тела, понижена температура тела, понижен уровень перекисного окисления липидов, а в старческом возрасте снижен уровень кортикостерона, глюкозы и IGF-1 в плазме крови по сравнению с контролем дикого типа (Miskin et al., 1999, 2005). Наблюдаются и изменения в репродуктивной функции. Так, на 14 % снижается число потомков в пометах и на 10 % снижена частота родов. Таким образом, эти трансгенные мыши как бы моделируют эффект ограничения калорийности питания, отличаясь от него тем, что у этих мышей уровень кортикостероидов снижен, тогда как при ограничении калорийности питания он повышен (см. главу 14). Еще одной особенностью мышей с геном a-MUPA является высокая частота тремора мышц конечностей, заметного при неустойчивом положении тела мышей. Важно отметить, что у трансгенных a-MUPA мышей снижена частота развития спонтанных опухолей (Miskin et al., 2005). При этом у этих мышей наблюдается обычная возрастная инволюция тимуса. Изуче- ние особенностей циркадианных ритмов и экспрессии часовых генов у мышей a-MUPA показало, что их отличает высокая устойчивость циркадианных ритмов, что, как полагают авторы, является важным фактором их долголетия (Froy et al., 2006).

67

Â.Н. Анисимов

12.5.11.Генетически модифицированные мыши

ñсенильной потерей веса и приапизмом (Priap 1)

Имеются данные о мышах линии CBAT6/T6, отличающихся исключи- тельным долголетием, сенильным синдромом и приапизмом у самцов (Adams et al., 2001). Cтарческое снижение веса тела у мышей этой линии начиналось на 71-й неделе жизни, и к 118-й неделе жизни все они имели сниженный вес. Приапизм развивался у самцов с 99-й до 144-й недели жизни. Средняя продолжительность жизни 15 мышей с приапизмом составила 144 9 недель, а максимальная — 162 недели. Мыши этой линии и их гибриды, несущие ген Priap1, отличались сниженной частотой развития спонтанных опухолей. Причина влияния этого гена на продолжительность жизни мышей не ясна. Авторы предполагают, что он каким-то образом регулирует взаимоотношения между генами циркадианных ритмов супрахиазматиче- ского ядра гипоталамуса и генами, определяющими эффективность репарации ДНК.

12.5.12.Генетически модифицированные мыши

ñпониженной температурой тела

Методами генной инженерии получили мышей, у которых повышалась температура особых нейронов в преоптической области гипоталамуса, регулирующей температуру тела (Сonti et al., 2006). У этих мышей исключи- тельно в гипокретиновых нейронах (Hcrt) избыточно экспрессирован ген разобщающего белка 2 (UCP2). Этот белок внутренней мембраны митохондрий разобщает окислительное фосфорилирование и дыхание, перенося ион водорода из межмембранного пространства в матрикс, что приводит к рассеиванию градиента энергии протона в форме тепла. Гипокретины 1 и 2, называемые также орексинами, являются нейропептидами, происходящими из общего предшественника, который участвует в регуляции цикла сон/пробуждение, баланса энергии, потребления корма, функции эндокринной и автономной нервной системы. У трансгенных Hcrt-UPC2 мышей наблюдалось снижение температуры тела на 0.3—0.5 °С. Животные получали обыч- ную диету, потребляли сравнимое с контролем количество корма, но поскольку они были более двигательно активными, тратили больше энергии на поддержание жизнедеятельности, то весили меньше и жили на 12 % (самцы) и 20 % (самки) дольше своих генетически нормальных собратьев. Следует заметить, что средняя продолжительность жизни самок мышей C57BL/6, c 6-недельного возраста содержавшихся в течение всей последующей жизни в помещении с пониженной температурой воздуха (7 ± 2 °С), не отличалась существенно от мышей, содержавшихся при обычной комнатной температуре (Selman et al., 2006).

Интересно, что содержание самцов мутантных дрозофил с мафусаиловым геном (mth) при пониженной температуре уменьшало продолжитель-

68

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

ность их жизни пропорционально степени ее снижения (с 25 °С до 18 и 4 °С), тогда как у самок лишь повышение температуры до 29 °С увеличивало ее продолжительность (Mockett, Sohal, 2006).

12.6. ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЖИЗНИ МЫШЕЙ, КЛОНИРОВАННЫХ ИЗ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

Успешное клонирование животных открывает новые перспективы для исследований в области перепрограммирования генома, импринтинга, эмбрионального развития, а также клинических приложений для заместительной клеточной, тканевой и органной терапии.

Первая клонированная мышь, названная Cumulina, прожила 2 года и 7 месяцев, что очень долго для мыши с ожидаемой продолжительностью жизни 2 года (Aldhous, 2000). У Кумулины в возрасте 2 лет развилась доброкачественная папиллома кожи. В остальном никакой патологии у нее выявлено не было.

Â2002 г. была опубликована работа о продолжительности жизни 12 мышей, которые были получены путем клонирования незрелых клеток Сертоли (Ogonuki et al., 2002). Контролем служили мыши-самцы одинакового генетического статуса (гибриды F1, C57BL/6 DBA/2; B6D2F1), полученные путем обычного спаривания самца и самок (7 мышей) или инъекцией сперматид (6 мышей). Набор веса тела при половом созревании клонированных мышей не отличался существенно от набора веса контрольных животных. Биохимические параметры исследовались у мышей обеих групп в возрасте 3 и 14 месяцев. Из 16 исследованных показателей только уровень лактатдегидрогеназы и аммония был повышен у клонированных мышей по сравнению с контролем. Клонированные мыши начали погибать в возрасте 311 дней после рождения, и 10 из 12 клонированных мышей умерли до достижения ими 800-дневного возраста. Только одна контрольная мышь, полученная от естественного спаривания, и две мыши, полученные путем инъекции сперматид, умерли до этого срока. Таким образом, скорость старения клонированных мышей была существенно большей, чем мышей дикого типа. Аутопсия была произведена у 6 клонированных мышей.

Óвсех мышей была обнаружена пневмония, у 4 из 6 мышей были выявлены обширные очаги некроза печени, в одном случае был выявлен лейкоз и еще в одном — рак легкого. Исследование иммунологического статуса показало снижение титра продуцируемых антител к введенным Mycobacterium bovis, а также уменьшение фагоцитарной активности. Две из 12 клонированных мышей пережили 800-дневный срок. Об их продолжительности жизни и продолжительности жизни мышей контрольных групп не сообщается.

Âдругой работе мышиные клоны были получены микроинъекцией клеточных ядер от взрослых (8—10-недельных) гибридных мышей B6С2F1

69

В. Н. Анисимов

(C57BL/6 C3H/He) в энуклеированные яйцеклетки, полученные от 8— 10-недельных мышей B6D2F1 (C57BL/6 DBA/2). Преимплантированные эмбрионы пересаживали псевдобеременным мышам линии CD-1, служившим суррогатными матерями. Одну группу контрольных мышей составили животные, которые были получены с соблюдением всех тех же технологи- ческих манипуляций, за исключением пересадки ядер клеток (мыши IVEM), а в другую вошли мыши, размножавшиеся естественным спариванием (Tamashiro et al., 2003). Авторы не нашли никаких различий в развитии и поведении между клонированными и контрольными мышами. Продолжительность жизни 6 клонированных из взрослых клеток мышей B6С2F1 составила 776 76 дней против 890 дней интактных контрольных мышей (p > 0.05). Показатели для 5 клонированных и контрольных мышей B6D2F1 составили соответственно 817 41 и 850 дней. Не было выявлено каких-либо различий в гистопатологии или причинах смерти между клонированными и контрольными мышами — это были лейкоз, аденокарцинома, лимфома и дегенерация миокарда. Интересной находкой оказалось выявление избыточного веса у клонированных мышей, связанного с гиперлептинемией и гиперинсулинемией. Клонированные мыши не потребляли больше корма, чем контрольные мыши. Была выявлена большая чувствительность тканей клонированных животных к лептину и инсулину. Обсуждая возможные причины различия полученных в этой работе данных с наблюдениями Ogonuki и соавт. (2002), наблюдавших укорочение продолжительности жизни клонированных мышей B6D2F1, Tamashiro и соавт. (2003) полагают, что это различие могло определяться несколькими факторами. Среди них — различие в типе клеток, использованных для клонирования, и возрасте животных, от которых были получены эти клетки.

M. Saito и соавт. (2004) использовали фибробласты 15.5-дневных эмбрионов мышей линии ICR для получения клонированных животных. Всего была получена одна клонированная мышь-самка. Она развивалась нормально и ее вес был несколько меньшим, чем средний вес тела пяти контрольных мышей. У нее был выявлен экзофтальм и она была умерщвлена в возрасте 1.8 года для выявления возможной инфекции. Однако патогенных микроорганизмов в организме клонированной мыши выявлено не было. Сравнивая результаты своей работы с данными других исследователей, авторы заключают, что клонированные мыши могут быть получены на любой линии мышей и не обязательно умирают в молодом возрасте.

Следует заметить, однако, что первые успешные попытки получения клонированных животных, несмотря на их важность, не позволяют сделать серьезных выводов о том, каким образом клонирование влияет на продолжительность жизни таких особей. Число животных слишком мало для этого. Необходимость дальнейших исследований в этом направлении обсуждается в литературе и не представляется безусловно очевидной.

70