2 курс / Нормальная физиология / Молекулярные_и_физиологические_механизмы_старения_в_2_т_,_Т_2_Анисимов

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

Ò à á ë è ö à 14.4

Динамика изменений экспрессии генов в головном мозге, скелетных мышцах и сердце мышей при старении

и ограничении калорийности диеты (Park, Prolla, 2005, с изменениями)

121

уровень белка Sirt-1, но он не изменен у мышей GHR–/–, содержащихся на диете ad libitum.

4) Экспрессия генов, регулирующих инсулин и IGF-1, в различных органах по-разному модифицируется диетой и мутациями, приводящими к долголетию. Например, ограничение корма стимулирует сигнал гена IRS-1 в печени и снижает его в мышцах у нормальных мышей, тогда как у мышей GHR–/–, содержащихся на такой диете, экспрессия этого гена не изменяется в печени, хотя снижается в мышцах.

Авторы полагают, что хорошо документированное увеличение экспрессии генов PGC-1a (коактиватор-1a ãåíà PPAR-g) è Sirt-1, наблюдаемое у животных, содержащихcя на калорийно ограниченной диете, не имеет существенного значения для увеличения продолжительности жизни или не эффективно у мышей, у которых действие гормона роста блокировано генетическими модификациями (Bartke et al., 2007).

В табл. 14.4 приведены основные результаты изучения в экспрессии генов при старении и его замедлении диетой уменьшенной калорийности у мышей. Следует подчеркнуть, что применение этих методов имеет свои ограничения (см. главу 3), и результаты, полученные с их использованием, не всегда возможно трактовать однозначно. Кроме того, изменения в уровне мРНК транскриптов не всегда отражают изменения в экспрессии генов.

Отмечают, что изменения экспрессии, которые, как полагают, ведут в конечном счете к увеличению продолжительности жизни и снижению час-

122

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

тоты развития опухолей, проявляются уже в течение первых 8 недель после начала применения калорийно ограниченной диеты мышей (Spindler, 2005).

При изучении в течение 9 лет влияния ограниченной калорийно диеты на профиль транскриптома в скелетных мышцах обезьян было установлено, что если при нормальном старении происходила активация генов, вовлеченных в воспаление и окислительный стресс, и угнетение экспрессии генов, участвующих в транспорте электронов в митохондриях и окислительном фосфорилировании, то при голодании увеличивалась экспрессия генов биосинтеза белка и уменьшение активности генов, регулирующих биоэнергетику митохондрий (Kayo et al., 2001). Авторы подчеркивают тот факт, что у обезьян ограничение калорийности диеты не оказывало какого-либо угнетающего влияния на экспрессию генов, наблюдающуюся при нормальном старении. Поэтому возможно, что такая диета замедляет старение у приматов на транскрипционном уровне, если животных переводят на нее в достаточно молодом возрасте. Другим объяснением этих результатов может быть предположение, что влияние калорийно ограниченной диеты на экспрессию генов имеет место только у короткоживующих видов и играет незначительную роль у приматов.

Â2000 г. исследованиями группы, возглавляемой L. Guarente, было установлено, что для увеличения репликативной продолжительности жизни дрожжей Saccharomyces cerevisiae необходима функция гена SIR2 (Lin et al., 2000). Этот ген кодирует белок sir2, являющийся НАД-зависимой гистоновой деацетилазой. Предполагалось, что этот белок, являющийся членом семейства сиртуиновых белков, увеличивает продолжительность жизни, уменьшая интенсивность метаболизма и/или снижая продукцию АКФ. Позднее группа D. Sinclair подтвердила эти данные и установила, что наряду с белком sir2 в этом процессе участвует ген PNC1, кодирующий никотинамидазу, деаминирующую никотинамид в никотиновую кислоту (Anderson et al., 2003). Никотинамид является ингибитором деацетилазной активности белка sir2, а никотинамидаза увеличивает деацетилазную активность этого белка, снижая уровнь его ингибитора. Поскольку при этом было выявлено, что ограничение калорийности питания увеличивает уровень белка pnc1 и, что особенно важно, осмотический и тепловой стресс его также увеличиваются, эти данные послужили основанием для выдвижения гормезисной гипотезы действия такой диеты (Мasoro, 1998) (см. ниже). Недавно было установлено, что подавление рапамицин-чувствительной протеинкиназы (TOR) увеличивает у дрожжей продолжительность жизни таким же образом, как и ограничение калорийности питания, а именно увеличивая активность Sir2 и стабилизируя локус рДНК (Medevedik et al., 2007).

Âдальнейшем исследованиями группы L. Guarente были получены доказательства существенной роли сиртуинового белка Sirt1 в вызываемом ограниченной калорийно диетой увеличении продолжительности жизни млекопитающих (Picard et al., 2004; Guarente, 2005). В этой работе сверэкспрессия Sirt1 угнетала накопление жира в мышиных фибробластах 3T3-L1, обработанных инсулином, дексаметазоном и изобутилметилксантином, т. е.

123

В. Н. Анисимов

этот белок действовал как репрессор генов, определяющих адипогенез и накопление жира в клетках.

Более того, добавление в культуральную среду активатора Sirt1 ресвератрола также снижало уровень жира и стимулировало его мобилизацию. У мышей в возрасте 12—16 недель с частично выключенным этим белком (Sirt1+/–) наблюдалось снижение уровня свободных жирных кислот в плазме крови после ночного голодания, хотя степень мобилизации жира белыми адипоцитами была ниже, чем у мышей Sirt1+/+. Авторы полагают, что уменьшение накопления жира в белых адипоцитах является первичным механизмом, которым ограниченная калорийно диета увеличивает продолжительность жизни у мелкопитающих. Однако E. J. Masoro (2004) cчитает такое заявление преждевременным, поскольку ночное голодание не может считаться эквивалентным длительному ограничению калорийности питания. Анализируя данные, полученные на FIRKO мышах c выключенным геном инсулинового рецептора в жировой ткани (Bluher et al., 2003), E. Masoro справедливо отмечает, что в этой работе также отсутствуют доказательства участия снижения уровня жира в увеличении продолжительности жизни. В поддержку своей точки зрения он приводит данные об отсутствии корреляции между содержанием жира в теле и продолжительностью жизни у самцов крыс F344, содержавшихся на ad libitum диете и положительной корреляции у крыс, содержавшихся на ограниченной диете (Bertrand et al., 1980). Более того, хотя генетически жирные мыши ob/ob при условии свободного доступа к корму не жили так долго, как в таких же условиях тощие мыши дикого типа, ob/ob мыши на ограниченной по калорийности диете, имели 48 % жира в теле и жили дольше, чем тощие мыши дикого типа на ad libitum диете (22 % жира в теле), и так же долго, как тощие мыши на ограниченной диете, имевшие только 13 % жира в теле (Harrison et al., 1984).

Âопытах на крысах, содержавшихся с момента отъема от грудного вскармливания на ограниченной калорийно диете, было установлено, что у них повышена экспрессия гена Sirt1 в мозге, печени, почках и висцеральной жировой ткани по сравнению с крысами, содержавшимися на диете без ограничений (Cohen et al., 2004). В этой работе было также выявлено, что сниженный уровень инсулина и IGF-1 ответственны за увеличение уровня Sirt1 в культуре эмбриональной почки человека при добавлении сыворотки крови от голодавших крыс, а также что ограниченная калорийно диета усиливает деацетилазную активность белка sir2, уменьшая экспрессию гена SIRT1.

При добавлении в питательную среду ресвератрола или других веществ, стимулирующих деацилазную активность сиртуиновых белков, наблюдалось увеличение продолжительности жизни нематод C. elegans и плодовых мух D. melanogaster (Wood et al., 2004). При этом ресвератрол не увеличи- вал дополнительно продолжительность жизни животных на ограниченной калорийно диете.

Âопытах, проведенных на C. elegans, было показано, что ограничение питания активирует в нейронах их головы транскрипционные факторы

124

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

SKN-1 и PHA-4, регулирующие многие гены и дающие сигнал перифериче- ским тканям увеличивать их метаболическую активность, т. е. включающим механизм вовлечения эндокринной системы (Bishop, Guarente, 2007; Panowski et al., 2007). Эти данные могут способствовать поиску новых миметиков ограниченной калорийно диеты.

14.4.2.Влияние на апоптоз

Âцитированной выше работе (Cohen et al., 2004) было также показано, что клетки эмбриональной почки человека (линия 293T) в культуре с добавлением сыворотки от крыс, содержавшихся на ограниченной калорийно диете, были более устойчивы к апоптозу, опосредованному геном Bax (Cohen et al., 2004). Вывод этих авторов, что Sirt1 замедляет старение, ослабляя апоптоз, противоречит точке зрения H. R. Warner и соавт. (1995), полагающих, что именно торможение апоптоза приводит к замедлению старения при ограничении калорийности питания. На самом деле существуют доказательства возможности обоих механизмов. Так, хотя ограничение калорийности питания ослабляет возрастное усиление апоптоза в головном мозге крыс (Hiona, Leewenburgh, 2004), оно усиливает апоптоз в печени старых мышей (Mushkelishvili et al., 1996), толстой и тонкой кишке старых крыс. Однако следует заметить, что в работе H. Y. Cohen и соавт. (2004) подчеркивается способность ограниченной калорийно диеты тормозить апоптоз, индуцируемый стрессом. Вместе с тем имеются довольно противоречивые данные на этот счет. Так, B. Grasl-Kraupp и соавт. (1994) показали, что такая диета усиливает как базальный, так и индуцируемый повреждением апоптоз в печени, тогда как K. Ando и соавт. (2002) обнаружили торможение под влиянием такой диеты апоптоза, индуцируемого стрессом. Обсуждение роли апоптоза в старении (Zhang, Herman, 2002) привело авторов к заключению, что имеющихся данных недостаточно для вывода, что механизм увеличения продолжительности жизни при калорийно ограниченной диете обусловлен усилением апоптоза.

14.4.3.Влияние на окислительный стресс

Â1996 г. R. Sohal и W. Weindruch (1996) и независимо от них B. P. Yu (1996) предположили, что геропротекторный эффект ограниченной по калорийности диеты связан с ослаблением развивающихся с возрастом окислительных повреждений. Было убедительно показано, что у таких животных снижается уровень повреждений липидов, белков и нуклеиновых кислот. Установлено, что при длительном содержании на ограниченной калорийно

диете генерация в митохондриях O–2 è Í2Î2 снижается (Sohal, Weindruch, 1996). Однако убедительных данных об изменении активности ферментов системы антиоксидантной защиты при этом не обнаружено (Sohal, 2002; Bokov et al., 2004).

125

В. Н. Анисимов

Полагают, что утрата белками под влиянием АФК сульфгидрильных групп (-SH), наблюдающаяся во многих органах и тканях организма, вклю- чая головной мозг, сердце, скелетные мышцы и почки, является одним из наиболее существенных проявлений окислительного стресса при старении. У животных, находившихся на калорийно ограниченном рационе, степень возрастного снижения сульфгидрильных групп белков была существенно снижена (Agarwal, Sohal, 1994). Аналогичный эффект наблюдали при изу- чении уровня карбонильных групп в белках мышей, содержавшихся на такой диете (Foster et al., 2000). Наибольший защитный в отношении окислительного стресса эффект ограниченного по калорийности питания проявляется в постмитотических клетках головного мозга, сердца и скелетных мышц.

В ряде работ исследовалось влияние ограниченной калорийно диеты на продукцию АКФ. Было установлено снижение их генерации митохондриями, выделенными из сердца и печени, причем введение инсулина устраняло этот эффект (Lambert, Merry, 2004). G. Barja (2004) полагает, что замедление старения, вызываемое калорийно ограниченной диетой, обусловлено как снижением генерации АФК митохондриями, так и снижением окислительного повреждения митохондриальной ДНК в тканях животных, определяемого по уровню 8-гидроксигуанозина в мтДНК. В ядерной ДНК такого снижения уровня повреждений не наблюдалось. У крыс это уменьшение продукции митохондриальных АФК происходит в комплексе I в сердце и печени крыс и пропорционально степени редукции переноса электронов в комплексе I генератора АФК.

Следует отметить, что у трансгенных Big Blue мышей, несущих шаттл-вектор lacI, позволяющий идентифицировать соматические мутации, ограничение калорийности питания не приводило к сколько-нибудь существенному снижению частоты мутаций или их специфичности (Stuart et al., 2000). Мыши Big Blue позволяют с высокой точностью и надежностью выявлять мутации по типу замен пар оснований или небольшие делеции, тогда как большие делеции и хромосомные аберрации с помощью этой модели выявить не удается. Показано, что у животных, содержавшихся на калорийно ограниченном рационе, снижена экспрессия некоторых генов репарации ДНК (Petrini, 1999). Вместе с тем калорийно ограниченная диета существенно угнетала мутагенез, индуцируемый афлатоксином В1 у мышей (Сasciano et al., 1996).

Одним из механизмов уменьшения продукции митохондриями АФК при ограничении калорийности питания, как предполагают, является снижение в диете уровня метионина (Sanz et al., 2006). Действительно, снижение концентрации метионина в диете с 0.86 до 0.17 % увеличивало продолжительность жизни самцов крыс F344 на 30 % (Orentreich et al., 1993).

У долгоживущих карликовых мышей Snell (dw/dw), карликовых мышей Ames (df/df) и мышей с нокаутированным геном рецептора гормона роста (GHR-KO) наблюдалась большая устойчивость тканей ко многим цитоток-

126

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

сическим агентам по сравнению с мышами дикого типа. Однако фибробласты мышей dw/dw и GHR-KO, содержавшихся на калорийно ограниченной диете, не были более резистентны к окислительному стрессу, индуцируемому ультрафиолетовым облучением, перекиcью водорода или кадмием, чем фибробласты контрольных животных (Harper et al., 2006). Эти наблюдения свидетельствуют о том, что устойчивость к стрессу при ограниченной калорийно диете может проявляться различным образом, в зависимости от использованной экспериментальной модели. Одним из возможных механизмов, которым может реализоваться защитное действие ограниченной калорийно диеты, может быть уменьшение перекисного окисления мембран клеток (Yu, 1996).

14.4.4. Влияние на систему глюкоза—инсулин—гормон роста—IGF-1

Как уже отмечалось выше, ограничение калорийности питания вызывает стойкое снижение уровня глюкозы и инсулина в плазме крови, а также многих других гормонов, что позволило назвать этот метод «псевдогипофизэктомией» из-за схожести вызываемых эффектов (Everitt et al., 1980). Исходя из этих данных, а также наблюдений о том, что гипергликемия и гиперинсулинемия оказывают повреждающий эффект, весьма сходный с наблюдаемым при старении, E. J. Masoro (2000) предположил, что геропротекторное действие калорийно ограниченной диеты обусловлено именно этим механизмом. Было установлено, что такая диета уменьшает гликозилирование белков и накопление продуктов глубокого гликозилирования (AGE, см. главу 4). Скелетные мышцы животных, содержавшихся на ограниченной по калорийности диете, были более чувствительны к действию инсулина (Cartee et al., 1994). Гипофизы животных на калорийно ограни- ченной диете продуцируют меньше гормона роста, в их крови снижены концентрации IGF-1 и гормона роста (Sonntag et al., 1999), что, как полагают авторы, является ведущим фактором увеличивающего продолжительность жизни действия калорийно ограниченной диеты. Данные о существенном увеличении продолжительности жизни у карликовых мышей Эймса и мышей с нокаутированным геном рецептора IGF-1 (см. главу 12) соответствуют этому предположению. Интересно, что если карликовых мышей содержать на калорийно ограниченной диете, то происходит дополнительное увеличение продолжительности жизни мышей (Bartke et al., 2003), что позволило авторам высказать предположение о том, что механизмы увеличе- ния продолжительности жизни в этих двух случаях не идентичны. Отмече- но, что характер изменения кривых выживаемости при этом тоже различен: у карликовых мышей имеет место параллельный сдвиг кривой вправо, что свидетельствует о замедлении начала старения, тогда как при ограничении калорийности питания имеет место замедление скорости популяционного старения (Masoro, 2003).

127

Â.Н. Анисимов

14.4.5.Влияние на репродуктивную систему

Как упоминалось, уже в первых экспериментах с ограничением питания было выявлено замедление старения репродуктивной системы. Когда кры- сы-самки содержались на ограниченной диете с 45-го дня жизни до возраста 6 месяцев, они сохраняли способность к размножению до 16—23-месяч- ного возраста, когда контрольные самки уже были стерильны (Osborne, Mendel, 1917; цит. по: Masoro, 2003). Впоследствии было установлено, что у молодых самок крыс калорийно ограниченная диета все же снижает фертильность, хотя она дольше сохраняется по сравнению с контрольными животными (Merry, Holehan, 1979). При этом у крыс реже была частота эстральных циклов, а число плодов в пометах уменьшалось. Оказалось, что в отличие от самок калорийно ограниченная диета у самцов крыс не замедляет возрастного снижения репродуктивной функции (Merry, Holehan, 1979). Было установлено, что у 22-месячных самок мышей, длительно содержавшихся на такой диете, сохраняется высокий уровень рецепторов к эстрогенам в ядрах гипоталамуса, регулирующих овуляторный выброс гонадотропинов, характерный для молодых животных (Timiras et al., 2005). При ограничении калорийности рациона не наблюдается возрастного снижения функции эпифиза (Stokkan et al., 1991), гормоны которого играют важную роль в регуляции репродукции и антиокислительной защитной системы организма и обладают отчетливым геропротекторным эффектом. Интересно, что у некоторых видов животных ограничение потребления корма не вызывает изменений репродуктивной способности (Kirk, 2001; Сarey et al., 2002).

Интересны результаты ограничения калорийности корма у дрозофил, достигаемого разведениями питательной среды (Patridge et al., 2005). Снижение концентрации корма вначале приводило к увеличению продолжительности жизни, которое достигало своего максимума, а затем, при дальнейшем уменьшении питания, наблюдалось ее сокращение. При этом ежедневное число откладываемых самками яиц снижалось линейно пропорционально снижению концентрации питательной среды.

14.4.6. Влияние на иммунную систему

Замедление возрастных изменений в иммунной системе может иметь существенное значение для геропротекторного действия ограниченной калорийно диеты. Имеются данные, что при содержании мышей на такой диете с одномесячного возраста увеличивает задержку наивных CD4 и CD8 Т-клеток в периферической крови и селезенке (Masoro, 2003; Nikolich-Zu- gich, Messaoudi, 2005). Этот эффект наблюдается уже в возрасте 3 месяцев и сохраняется до 30-месячного возраста. Остается неясным, однако, увеличи- вает ли ограниченная по калорийности диета абсолютное и относительное количество наивных клеток у мышей, стимулируя их продукцию в тимусе, улучшая их поддержание в периферической крови, замедляя избыточную

128

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

Ò à á ë è ö à 14.5

Влияние старения и ограниченной калорийно диеты на параметры иммунной системы у грызунов и приматов

(Nikolich-Zugich, Messaoudi, 2005, с изменениями)

активацию Т-клеток, или замедляя трансформацию наивных клеток в клетки памяти.

Длительное ограничение калорийности питания восстанавливает пролиферативную способность Т-лимфоцитов при стимуляции митогенами. Показано, что этот эффект может быть связан как с увеличением апоптоза старых клеток, так и их повышенной уязвимостью к повреждающему действию свободных радикалов (Nikolich-Zugich, Messaoudi, 2005).

У мышей (NZB NZW)F1, подверженных аутоиммунным заболеваниям, таким как системная красная волчанка, колит, увеоретинит, ограниченная калорийно диета снижает частоту и уменьшает тяжесть аутоиммунной патологии (Jolly, 2004). При этом в плазме крови снижается уровень провоспалительных цитокинов (IL-6, IL-12, TNF-a, IFN-g) и увеличивается уровень иммуносупрессорных цитокинов, таких как TGF-b и IL-10. Аналогичный эффект наблюдался и у обычных, не имеющих аутоиммунных заболеваний мышей, однако отсутствовал у крыс линии Brown Norway (Nikolich-Zugich, Messaoudi, 2005).

Сравнительный анализ эффектов старения и ограниченной калорийно диеты на параметры иммунной системы у мышей и обезьян (табл. 14.5) показал, что они во многом схожи. Вместе с тем указывают на многие еще остающиеся неясными моменты в механизме действия ограниченной по калорийности диеты на состояние иммунной системы (Nikolich-Zugich, Messaoudi, 2005).

Недавно I. Messaoudi и соавт. (2006) сообщили, что такая диета замедляет возрастные изменения иммунитета у макак-резус. Было установлено, что 19- и 23-летние обезьяны (средняя продолжительность жизни макак-резус в неволе — 25 лет), содержавшиеcя на диете, ограниченной по калорийности на 30 % на протяжении большей части взрослой жизни (13—18 лет), имели меньшие изменения в зависимом от возраста соотношении «наивных»

129

В. Н. Анисимов

Т-клеток к Т-клеткам памяти, чем контрольные особи. Разнообразие Т-кле- точных рецепторов также лучше сохранилось у обезьян на ограниченном рационе. Известно, что при старении имеет место тенденция к увеличению продукции воспалительных цитокинов, секретируемых стимулированными Т-клетками памяти, и это изменение также было менее выражено у макак, содержавшхся на калорийно ограниченной диете, но не для всех цитокинов. Авторы отметили, что эффекты кратковременного воздействия такого рациона на иммунитет, т. е. наблюдаемые через 2—4 года ограничения диеты, подобны таковым при самом старении, однако еще 10 лет продолжавшееся ограничение ослабило эти специфические стороны иммуностарения.

Полученные доказательства того, что кратковременное (до 4 лет) и долговременное ограничение калорийности питания может иметь противоположные эффекты на иммунитет у макак-резус, имеют важное значение при разработке новых проектов и интерпретацию продолжающихся и будущих исследований эффектов ограниченной калорийно диеты у людей. В дополнение новые исследования на лабораторных мышах поставили важные вопросы о том, как такая диета может влиять на ответ на инфекции. В частности, в двух работах (в тесте на внутрибрюшинное введение полимикробной смеси и тесте на введение вируса мышиного гриппа) было показано, что при ограничении калорийности питания увеличивается заболеваемость и смертность мышей (Sun et al., 2001; Gardner, 2005). Данные о том, что ограничение калорийности питания может повышать чувствительность по крайней мере к некоторым инфекционным заболеваниям, должны учитываться в ведущихся исследованиях по влиянию такой диеты на людей.

14.4.7.Гормезис

Â1998 г. E. Masoro высказал предположение, что гормезис также может быть одним из механизмов геропротекторного действия ограниченной по калорийности диеты, которую можно рассматривать как мягкий стрессирующий фактор. У крыс и мышей при этом повышена продукция стрессорных белков в ответ на повреждение, повышен уровень кортизола в крови и часто снижен иммунитет (Masoro, 2003, 2005).

Важно отметить, что перевод животных на ограниченную по калорийности диету (на 40 % и более) сопровождается гибелью части подопытных животных (до 30 %) на первых этапах адаптации, что, по сути, производит жесткий отбор потенциальных «долгожителей». У отобранных таким образом особей голодание замедляет процессы развития и возникновения ассоциированных с возрастом патологических процессов, увеличивает их продолжительность жизни (Божков, 2001). Животные, находящиеся на калорийно ограниченной диете, весьма подвержены действию стрессирующих факторов, что диктует необходимость содержания их в условиях, сводящих до минимума возможные воздействия внешней среды (Божков, 2001; Masoro, 2003). У млекопитающих такая диета приводит к индукции белка SIRT1,

130