2 курс / Нормальная физиология / Молекулярные_и_физиологические_механизмы_старения_в_2_т_,_Т_2_Анисимов

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

была угнетена фертильность и наблюдались кифоз и признаки остеопороза. Важной находкой у старых трансгенных p44 мышей было обнаружение избыточного уровня IGF-1 в сыворотке крови и тканях. Авторы установили, что p53 контролирует ось IGF-1 на самых ранних этапах, модулируя эффекторы как роста, так и пролиферации. Поскольку было показано, что ð44 угнетает рост только в присутствии полноразмерного ð53, было решено полу- чить трансгенных ð44 мышей на фоне выключенного ð53. Полученные мыши оказались нормального размера. Более того, эти мыши были весьма предрасположены к развитию опухолей (примерно в той же мере как и ð53–/– мыши), тогда как мыши только с сверхэкспрессией р44 имели очень низкую частоту опухолей. Таким образом, избавление от р44 фенотипа в отношении размеров тела сказывалось и в отношении риска развития новообразований. Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что угнетающий рост эффект р44 на клеточном и организменном уровне требует участия ð53. Важно подчеркнуть, что эффект ð53 обусловлен его регулирующим действием на систему проведения сигнала в оси IGF-1/инсулин в нескольких ключевых точках. Во-первых, ð53 контролирует рецептор IGF-1. Во-вторых, он контролирует уровень и активность двойной липид-протеи- новой фосфатазы (PTEN), которая модулирует передаваемый IGF-1 сигнал на Akt, главным образом посредством дефосфорилирования фосфати- дил-инозитол трифосфата. В целом вмешательство р44 приводит к инактивации PTEN. Эти наблюдения позволяют дать объяснение парадоксально малому размеру тела трансгенных ð44 мышей при избыточной продукции IGF-1. Работа Maier c cоавт. (2004) соответствует данным, полученным ранее Tyner c соавт. (2002) о роли ð53 в старении млекопитающих. У мышей с одним мутантным аллелем ð53, кодирующим дефектный продукт гена и одним интактным аллелем, клетки теряют способность к регенерации старения или поврежденных тканей (Tyner et al., 2002). Мыши, несущие дополнительные копии полного локуса ð53, нормально растут и стареют (Gar- cia-Cao et al., 2002), что вместе позволяет предполагать, что для нормальной функции ð53 необходимо соответствие короткой и длинной форм ð53. Даже небольшое увеличение уровня р44 приводит к повышению уровня р53, одним из следствий которого является изменение нормального отношения р44:р53, приводящее к увеличению общей активности ð53 (Maier et al., 2004).

Мыши с дефектным р53-подобным белком p63 (p63+/–) были сходны в некотором отношении с ð53+/m мышами, описанными S.D. Tyner и соавт. (2002). Они также были резистентны к развитию опухолей, у них была увеличена активность b-галактозидазы (Keyes et al., 2005). Cредняя продолжительность жизни мышей дикого типа была 125 недель, тогда как гетерозиготы p63+/– жили в среднем только 95 недель (p < 0.0001), что составило 21.5 % ее редукции. Только у 8 % мутантных мышей были обнаружены злокачественные опухоли. При гистологическом исследовании у них были выявлены гиперпластические процессы в коже, инфицирование кожных покровов и эпителия мочеполовых органов, вплоть до абсцедирования. При

41

Â.Н. Анисимов

Òà á ë è ö à 12.8

Характеристики мышей с различными модификациями генов семейства ð53

конструировании мышей с различными комбинациями изменений в экспрессии р63 и р53 было установлено, что инактивация р63 не увеличивает частоты развития опухолей даже у мышей с выключенным р53 (Keyes et al., 2006). Мыши ð63+/– не были более чувствительны к индукции опухолей кожи 7,12-диметилбенз(а)антраценом, чем мыши дикого типа. Авторы работы полагают, что белок р63 играет важную роль в модулирующих опухолевую супрессию механизмах, в частности в клеточном старении (табл. 12.8).

12.4.17. Мыши с нокаутом локуса INK4a/AFR

Делеции локуса INK4a/AFR (также называемого cdkn2a), локализованного у человека на хромосоме 9p21, — одна из наиболее часто встречающихся мутаций в злокачественных опухолях человека (глиобластоме, меланоме, аденокарциноме поджелудочной железы, раке легкого, мочевого пузыря и ротоглотки). Ген INK4a кодирует белок p16INK4a, ингибирующий клеточный цикл, тогда как ARF кодирует p14ARF (p19ARF у мышей), регулирующий стабильность p53 (Sharpless, 2004). Выключение только p16INK4a è/èëè ð53 не нарушает развития мышей, однако существенно сокращает продолжительность их жизни и увеличивает частоту развития новообразований (Sharpless, 2004).

42

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

12.4.18. Мыши с нокаутированным геном каспазы-2

Многочисленными исследованиями убедительно продемонстрирована роль апоптоза в развитии ряда ассоциированных со старением дегенеративных заболеваний (см. главу 4). Уровень апоптоза во многих тканях с возрастом увеличивается, чему соответствует возрастное увеличение активности в них ключевых медиаторов апоптоза — каспаз (Zhang et al., 2002а). Были сконструированы мыши с нокаутированной каспазой-2, которая участвует в апоптозе, индуцируемом разнообразными физиологическими сигналами, включая окислительный стресс (Zhang et al., 2002). Мышей Ñasp2–/– получа- ли путем делеции экзона, кодирующего QACRG активный сайт фермента и части следующего экзона, кодирующего короткую изоформу каспазы-2. Таким образом, нокаутированы были обе, длинная и короткая формы каспазы. Контролем служили однопометные мыши дикого типа. Средняя продолжительность жизни нокаутных и контрольных мышей оказалась почти одинаковой (903 и 935 дней соответственно). Однако, если максимальная продолжительность жизни мышей Ñasp2+/+ составила 1254 дня, то у мышей Ñasp2–/– она была на 4 месяца короче и cоставила 1137 дней. Log-rank тест для последних 50 % животных показал статистически достоверное (p < 0.01) различие в продолжительности жизни между этими двумя группами мышей. Авторы предполагали, что у дефицитных по каспазе мышей будет выше частота развития новообразований. Однако по этому показателю мыши Ñasp2–/– è Ñasp2+/+ не различались (55.2 и 39.3 % соответственно). Множественность развившихся новообразований составила в этих группах 0.66 и 0.44 соответственно. Однако если проанализировать представленные в статье данные о локализации и типе развившихся новообразований, то можно сделать вывод, что нокаут каспазы-2 сопровождается существенным (в 2.5 раза) снижением частоты развития злокачественных опухолей по сравнению с контролем (p < 0.05). При этом в 2.5 раза снизилась частота развития лимфом и в 3 раза — частота карцином легкого. Дефицит каспазы не приводил к изменению частоты развития неопухолевой патологии у нокаутных мышей. Однако у мышей Ñasp2–/– был меньше вес тела, наблюдалось снижение содержания жира в теле, облысение, остеопороз, выше уровень окисленных белков в печени. На основании полученных данных авторы пришли к выводу, что дефицит каспазы-2 приводит к ускоренному старению мышей.

12.4.19.Регуляция межклеточного взаимодействия

èтрансгенные модели

Межклеточным взаимодействиям в многоклеточных организмах придается ведущая роль в регуляции пролиферации, дифференцировки и апоптоза в процессах нормального развития и старения. Коннексины являются структурными составляющими щелевых контактов, через которые осущест-

43

В. Н. Анисимов

вляется перенос ионов, молекул вторичных мессенджеров и других метаболитов между контактирующими клетками (cм. главу 5). Исследования эндотелиальных клеток in vitro показали, что коннексины играют важную роль в процессе старения (Xie, Hu, 1994). Делеция различных генов коннексинов у мышей приводит к разнообразным повреждениям, включая рак, пороки сердца или нарушения проводимости, катаракту и т. д. (Yamasaki et al., 1999). Е. А. Modjanova и соавт. (1983) наблюдали снижение силы межклеточного сцепления в легких мышей линии А, предрасположенных к развитию спонтанной аденомы, а также в печени мышей линий СВА, С3H и С3НА, предрасположенных к развитию гепатом. Самцы и самки мышей с дефицитом коннексина-32 (Ñõ32–/–) в возрасте одного года имели соответственно в 25 и 8 раз большую* частоту спонтанных опухолей в печени, чем мыши дикого типа (Temme et al., 1997). Трансфекция генов коннексинов в опухолевые клетки восстанавливает нормальный клеточный рост, свидетельствуя о том, что коннексины могут быть отнесены к семейству онкосупрессорных генов (Yamasaki et al., 1999). Было показано, что у нокаутных Ñõ–/– мышей начиная с трехмесячного возраста развивается прогрессивная демиелинизирующая периферическая нейропатия преимущественно в двигательных волокнах (Scherer et al., 1998). У мышей с дефицитом гена Cx-32 существенно чаще развивались новообразования (прежде всего печени, легких и мозгового слоя надпочечников), и они были очень чувствительны к канцерогенному действию рентгеновского облучения (King, Lampe, 2004).

12.4.20. Теломераза: трансгенные и нокаутные мыши

Теломеры — повторяющиеся последовательности ДНК на концах линейных хромосом. При каждом делении клетки теломеры укорачиваются, что приводит к необратимой остановке роста, называемой репликативным старением. Полагают, что поддержание длины теломер существенно для процесса старения клеток. Перед тем как малигнизироваться, клетки проходят этап «клеточного», или «репликативного», старения. Поддержание длины теломер необходимо для предупреждения репликативного старения клеток и непрекращающейся пролиферации (иммортализации). Активность фермента теломеразы — клеточной обратной транскриптазы — реактивирована в клетках большинства злокачественных опухолей человека, что обеспечивает стабильную длину теломер добавлением повторов TTAGGG к теломерам (см. главу 5). Однако связь между процессами старения организма in vivo и укорочением теломер еще твердо не установлена.

Экспрессия каталитического компонента теломеразы человека — обратной транскриптазы теломеразы (hTERT), введенного в клетку, приводит к увеличению продолжительности жизни (репликативного потенциала) человеческих фибробластов в культуре, клеток эпителия пигмента сетчатки, кератиноцитов, эндотелиальных клеток капилляров и больших кровеносных сосудов без признаков репликативного старения и неопластической транс-

44

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

формации (Bodnar et al., 1998; Morales et al., 1999; Dickson et al., 2000). Однако следует заметить, что эктопической экспрессии hTERT недостаточно для иммортализации нормальных человеческих кератиноцитов и эпителиальных клеток молочной железы (Kiyono et al., 1998). При эктопической экспрессии hTERT наблюдается иммортализация клеток нормального мезотелия и дефицитной по белку p16 (INK4a) предопухолевой линии кератиноцитов (Dickson et al., 2000).

Таким образом, одной стабилизации длины теломер недостаточно для предотвращения клеточного старения кератиноцитов, но последующий медленный непрекращающийся рост, обусловленный экспрессией теломеразы, приводит к возникновению иммортализированных вариантов. Культура эпителиальных клеток молочной железы человека (НМЕС) с нормальным репликативным потенциалом в 55—60 удвоений, при инфицировании на 40-м пассаже ретровирусом, содержащим hTERT, сохраняет способность к удвоению популяции до 250-го пассажа (Wang et al., 1997). Увеличение экспрессии протонкогена с-myc в клетках HMEC-hTERT наблюдали с 107 до 135 удвоения популяции (Wang et al., 2000). Авторы делают вывод, что, хотя активация теломераз и увеличивает продолжительность жизни клеток НМЕС, это также обусловлено экспрессией c-myc и, таким образом, не является генопротекторным механизмом. Увеличение продолжительности жизни может быть связано с активацией TERT протонкогена с-myc, и иммортализация клеток лишь частично обусловлена экспрессией TERT. Эти наблюдения свидетельствуют о том, что к использованию h-TERT для продления жизни клеток человека в терапевтических целях нужно подходить с осторожностью (Wang et al., 2000).

Хотя было продемонстрировано, что иммортализированные трансфекцией hTERT клетки могут сохранять нормальный рост и механизм контроля дифференцировки, возможно, что утрата обусловленной белком р16 остановки роста (потеря RB/p16INK4a) и неограниченный репликативный потенциал предрасполагают такие клетки к последующими изменениям, которые могут привести к опухолевой трансформации. Было показано, что экспрессия hTERT совместно с большим Т-онкопротеином вируса SV40 и онкогеном ras приводит фибробласты и эпителиальные клетки почек человека к опухолевой трансформации (Hahn et al., 1999). Эти наблюдения несомненно доказывают то, что ограничение пролиферативного потенциала клеток человека контролируется функцией многих «часов» (Wynford-Thomas, 1999).

Нокаутные по теломеразе мыши являются удобной моделью для выяснения роли укорочения теломер на уровне организма. Были получены мутанты С57В6mTR–/–, у которых теломеры были короче, чем у мышей дикого типа со смешанным генотипом (C57BL6/129Sv) (Herrera et al., 1999). Эти мыши размножались только в течение четырех последовательных поколений, и выживаемость мышей mTR–/– последнего поколения была существенно сниженной по сравнению с мышами дикого типа. Половина нокаутных мышей 4 поколения умерла в возрасте до 5 месяцев. Это уменьшение выжи-

45

В. Н. Анисимов

ваемости с возрастом в последнем поколении сопровождалось укорочением теломер, стерильностью, атрофией селезенки, уменьшением пролиферативной способности В- и Т-клеток, аномальной гематологией и атрофией тонкой кишки. Потеря теломерной функции у мышей mTR–/– не приводила к развитию полного спектра классических патофизиологических симптомов старения (Lee et al., 1998; Rudolph et al., 1999). Однако связанное с возрастом укорочение длины теломер и сопутствующая ему генетическая нестабильность ассоциировались с сокращенной продолжительностью жизни, уменьшением способности реагировать на стрессы, например при заживлении ран и кровопотере. Следует отметить, что у мышей mTR–/– наблюдалось увеличение случаев возникновения злокачественных опухолей (в основном лимфом и тератокарцином) (Rudolph et al., 1999). Возникновение этих опухолей, как полагают, обусловлено хромосомной нестабильностью у этих мышей (Blasco et al., 1997; Greenberg et al., 1999). Недавно было показано, что поздние поколения мышей TERT–/–, которые имели короткие теломеры и дефицит теломеразы, резистентны к двухстадийному канцерогенезу кожи (Gonzales-Suarez et al., 2005).

Опыты с нокаутными по теломеразе мышами свидетельствуют о том, что зависящая от теломеразы хромосомная нестабильность генома способствует канцерогенезу (Artandi, DePinho, 2000). Различия в длине теломер существенным образом сказываются на спектре и цитогенетике опухолей (Artandi et al., 2000). У старых мышей с дефицитом теломеразы и гетерозиготных по р53 существенно изменяется спектр опухолей в сторону преимущественного развития эпителиальных опухолей, включая злокачественные новообразования молочной железы, толстой кишки и кожи. R. A. DePinho (2000) полагает, что эти наблюдения весьма существенны для понимания роли теломер и связанной с ними нестабильности генома в механизмах развития эпителиальных карцином у человека.

У трансгенных мышей с экспрессией каталитической субъединицы теломеразы (mTERT) наблюдалось развитие с большой частотой аденокарцином молочной железы, не развивающихся у мышей дикого типа (Artandi et al., 2002). Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что активация теломеразы в процессе канцерогенеза имеет по крайней мере два последствия: одно состоит в стабилизации коротких теломер и предупреждении неблагоприятных последствий дисфункции теломер, а другое — в том, что она определяет локализацию рака. Хотя первая активность может быть важной для большинства раков человека, последняя активность может промотировать канцерогенез только в некоторых тканях, включая молочную железу и кожу (Artandi et al., 2002). В связи с этим интересна точка зрения, что укорочение средней длины теломер может, с одной стороны, увеличивать продолжительность жизни, а с другой — увеличивать риск развития новообразований (Hertzog, 2006).

46

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

12.4.21. Трансгенные мыши, экспрессирующие ген рака молочной железы HER-2/neu

Человеческий протоонкоген с-HER-2/neu принадлежит к семейству ти- розин-киназных рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR) (Andrechek et al., 2000). Трансгенные мыши, несущие ген HER-2/neu, отличаются высокой частотой развития аденокарцином молочной железы и короткой продолжительностью жизни. В нашей лаборатории были изучены особенности старения трансгенных мышей HER-2/neu. Для сравнения была изуче- на низкораковая линия мышей SHR. Проведенные исследования показали, что у трансгенных мышей опухоли молочной железы возникают в более раннем возрасте, и их число нарастает гораздо быстрее, чем у мышей SHR. Так, первые опухоли у трансгенных и низкораковых мышей обнаружены соответственно в возрасте 135 и 390 дней; средний латентный период их выявления составил 236 5.9 и 484 14.9 сут. (p < 0.001) (табл. 12.9; рис. 12.2) (Anisimov et al., 2003a).

У трансгенных мышей-самок опухоли других локализаций обнаружить не удалось, тогда как у низкораковых мышей SHR отмечалось развитие лейкозов, опухолей легких и яичников. Возможно, это связано с тем, что из-за развития опухолей молочной железы трансгенные мыши погибали рано и не доживали до обнаружения опухолей других локализаций, которые у мышей SHR отмечали в возрасте 518—697 дней. Однако у трансгенных мы-

Ò à á ë è ö à 12.9

Сведения о продолжительности жизни и частоте развития аденокарцином молочной железы у самок трансгенных мышей HER-2/neu и мышей SHR

П р и м е ч а н и е. Различие с показателем в контроле статистически достоверно: * — p < 0.01; ** — p < 0.05.

47

В. Н. Анисимов

Рис. 12.2. Динамика выживаемости (À) и возникновения аденокарцином молочной железы (Á) у интактных самок мышей HER-2/neu и SHR.

Обозначения те же, что и на рис. 12.1.

шей часто отмечали неопухолевую патологию: поражение почек с кистозными изменениями канальцев, сморщиванием клубочков и интерстициальной мелкоклеточной инфильтрацией, а также атрофию фолликулов селезенки и атрофию печеночных балок. При этом в печени и селезенке отмечали скопление мелкозернистого содержимого. Отмеченные изменения напоми-

48

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

нали нарушения обмена веществ, наблюдаемые при амилоидозе. В последующих исследованиях было обнаружено, что у мышей HER-2/neu уже к 8-му месяцу жизни наблюдается существенное снижение в головном мозге содержания амилоид-деградирующего фермента неприлизина (Журавин и др., 2007). При этом в почках возрастных изменений уровня неприлизина не выявлялось. Кроме того, у этих мышей с возрастом снижался уровень экспрессии эндотелинпревращающего фермента (ECE-1) и активность a-секретазы. У 10-месячных животных содержание sAPPa в коре мозга было на 40 % ниже, чем у молодых особей. Поскольку скопления амилоида характерны для стареющих животных, а также отмечаются при процессах старения у человека, можно предположить, что инкорпорация онкогенов может ускорять старение. У исходной линии мышей FVB/N, на основе которой была полу- чена использованная нами линия HER-2/neu, патология почек не описана (Mahler et al., 1996).

При оценке экспрессии онкогена HER-2/neu в опухолях молочной железы иммуногистохимическим методом высокое содержание онкобелка HER-2/neu выявлено во всех исследованных опухолевых тканях, а также в предопухолевых очаговых пролифератах молочных желез. Высокий уровень экспрессии онкогенов в опухолях молочной железы был выявлен также с помощью цепной реакции полимеризации (Anisimov et al., 2003a). Наши данные согласуются с работами других авторов, которые выявили амплификацию и повышенную экспрессию онкогенов у мышей с высокой частотой опухолей молочной железы (Andrechek et al., 2000).

При изучении показателей гомеостаза и биологического возраста у трансгенных мышей по сравнению с мышами SHR отмечено следующее: более низкая температура тела, несмотря на большее потребление корма, что, по-видимому, связано с особенностями обменных процессов у трансгенных животных; нарушение эндокринного баланса, что отразилось в увеличении числа иррегулярных циклов (в 2.5 раза). Подобное нарушение характерно для раннего старения. Изучение содержания рецепторов эстрогенов показало наличие рецепторов эстрадиола-17b во всех исследованных образцах тканей опухолей у трансгенных мышей (2—9 Фмоль/мг белка), в то время как рецепторы прогестерона не были обнаружены (Anisimov et al., 2003, 2003a; Бернштейн и др., 2003). Сопоставление наших данных с литературными свидетельствует о том, что содержание стероидных рецепторов в опухолях молочной железы у мышей HER-2/neu является сравнительно невысоким и близко к уровню, отмеченному в спонтанных опухолях молочной железы мышей BALB/c (Lanari et al., 2001). Интересно, что если у самок мышей SHR уровень эстрадиола в плазме крови с возрастом снижался, у мышей HER-2/neu он не только не снижался, а даже увеличивался (Бажанова и др., 2007). При этом у трансгенных мышей в нейросекреторных центрах гипоталамуса (супраоптическом и паравентрикулярных ядрах) уменьшена степень апоптоза и повышен синтез вазопрессина, являющегося активным митогеном по сравнению с мышами SHR, что, возможно, создает необходимый гормонально-метаболический фон, благо-

49

Â.Н. Анисимов

Òà á ë è ö à 12.10

Показатели свободнорадикальных процессов

в различных органах самок мышей HER-2/neu и мышей СВА

Ï ð è ì å ÷ à í è å. a — p < 0.01, b — p < 0.001 — достоверное различие у молодых мышей HER-2/neu по данному параметру с показателями в сыворотке крови; c — p < 0.02, d — p < 0.01 — достоверное различие по параметру ГП с показателями свободнорадикальных процессов в головном мозге; f — p < 0.05, g — p < 0.01 — достоверное различие по данному параметру молодых и зрелых мышей HER-2/neu; 1 — p < 0.001 — достоверное различие у зрелых мышей СВА по данному параметру с показателями свободнорадикальных процессов в сыворотке крови; * — p < 0.05, ** — p < 0.01, *** — p < 0.001 — достоверное различие уровня свободнорадикальных процесов по данному параметру зрелых мышей HER-2/neu со зрелыми мышами СВА. Л-ХЛ — люминолзависимая хемилюминесценция; ОАА — общая антиокислительная активность; ДК — диеновые конъюганты; ОШ — основания Шиффа; ГП — глутатионпероксидаза; ГSТ — Глутатион-S-трансфераза.

приятствующий развитию аденокарцином молочной железы у трансгенных мышей.

Поскольку известно, что интенсивность старения и канцерогенеза зависит от уровня свободнорадикальных процессов, изучались различные параметры генерации свободных радикалов и состояния антиоксидантной системы защиты у трансгенных мышей в сопоставлении с мышами низкораковой линии СВА. Было установлено, что содержание некоторых продуктов

50