6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторные_методы_исследования_системы_гемостаза_и_диагностика

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ставропольская государственная медицинская академия»

НПО «РЕНАМ» МБООИ «Общество больных гемофилией»

Лабораторные методы исследования системы гемостаза и диагностика

нарушений гемокоагуляции

Учебное пособие

Ставрополь-Москва 2009

1

ÓÄÊ 616.15 – 07 (076.5)

От СтГМА: Ю.В. Первушин, С.Ш. Рогова, Н.И. Ковалевич От НПО «РЕНАМ»: А.А.Козлов, А.Л.Берковский, Т.М. Простакова

Лабораторные методы исследования системы гемостаза и диагностика нарушений системы гемокоагуляции. Учебное пособие. – Ставрополь-Москва. Изд. Москва - 2009.

Учебное пособие подготовлено для специалистов по клинической лабораторной диагностике и курсантов, обучающихся на циклах специализации и усовершенствования врачей на кафедре клинической лабораторной диагностики факультета последипломного образования Ставропольской медицинской академии

Рецензенты:

С.А.Васильев, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель лаборатории клинической коагулологии Гематологического научного центра Российской академии медицинских наук

А.Д. Макацария, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой акушерства и гинекологии Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова

2

3

Набор реагентов для определения протромбинового времени (Диагем-П) 44

ÍАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ФИБРИНОГЕНА (ÎÏÒÈÔИБРИНОГЕН-ÒÅÑÒ). 47

4

5

6

ВВЕДЕНИЕ

Система гемостаза – это многокомпонентный комплекс, являющийся важнейшей частью гомеостаза и представленный сложным взаимодействием прокоагулянтного, тромбоцитарного, фибринолитического звеньев, а также ингибиторами свертывания и фибринолиза. Эта сложная биологическая система обеспечивает сохранения крови в кровеносном русле в жидком состоянии

èмоментально реагирует на повреждение сосудистой стенки образованием сгустка.

Систему гемостаза образуют многие компоненты: эндотелий и субэндотелий сосудов, тромбоциты

èдругие клетки крови, плазменные белковые факторы и кофакторы, антикоагулянты, профибринолитики, ингибиторы и активаторы фибринолиза, небелковые медиаторы гемостаза, цитокины и многие другие компоненты, в том числе печень, селезенка, костный мозг.

Первыми в ответ на повреждение реагируют кровеносные сосуды и клетки: происходит спазм микрососудов, активация клеток эндотелия, секреция этими клетками биологически активных веществ, адгезия и агрегация тромбоцитов, образование тромбоцитарной пробки. Одновременно в процесс включаются плазменные ферментные системы, лавинообразно активирующие друг друга и обеспечивающие образование фибринового сгустка, препятствующего потере крови, и последующий его лизис, когда такая опасность исчезла. Противосвертывающие системы антитромбина III, протеина С и ряда других белков проводят тонкое регулирование механизма свертывания и фибринолиза.

Все факторы свертывания и фибринолиза синтезируются в основном в печени и постоянно циркулируют в плазме крови в неактивной форме проферментов, и для их активации требуется повреждающее воздействие.

Коагуляционный процесс является каскадом последовательных протеолитических реакций, в которых неактивный протеин или зимоген превращается в активированный энзим, который в свою очередь способствует превращению следующего зимогена в энзим и т.д. до образования фибринового сгустка.

Коагуляционные энзимы являются сериновыми протеазами, сходными по строению с пищеварительными ферментами (трипсин, химотрипсин).

Их принято обозначать римскими цифрами, от I до XIII, активированные формы – с добавлением буквы «а».

Одной из основных особенностей коагуляционной системы является необходимость наличия мембранных поверхностей и ионов металлов. Большинство реакций коагуляции происходит в результате образования макромолекулярных комплексов на отрицательно заряженной фосфолипидной поверхности. Комплекс ТЕНАЗА (от слова ten – десять) состоит из ф. IXa, VIIIа

èX и приводит к производству ф. Хa, тогда как комплекс ПРОТРОМБИНАЗА состоит из факторов Xa, Va и II и ведет к образованию ф. IIa - тромбина.

Важной характеристикой системы коагуляции является быстрота ответа и скорость реакции, ограниченность ответа участком повреждения, интегрированность с другими системами организма, в том числе с системой комплемента.

Современная теория свертывания крови была представлена в 1964 г. Rosemary Biggs и R. G. MacFarlane. В соответствии с этой теорией следует различать два пути свертывания крови: внутренний или контактный (повреждение внутри сосудов) и внешний (повреждение тканей), но это различие достаточно условно, так как in vivo происходит взаимодействие всех компонентов системы свертывания.

Все тесты по исследованию системы гемостаза имеют свои естественные ограничения, так как они только моделируют in vitro процесс свертывания крови, который происходит в живом организме. Для моделирования in vitro контактного (внутреннего) пути свертывания служит тест определения активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ). В этом тесте все необходимые компоненты инициации внутреннего пути свертывания вносятся извне.

Во внешнем пути свертывания ключевое место отводится тканевому фактору (ТФ) - гликопротеину, связанному с мембранами и присутствующему во многих тканях. Внешний путь свертывания принято in vitro моделировать тестом протромбинового времени, когда к исследуемой цитратной плазме, бедной тромбоцитами, добавляют так называемый тромбопластин, представляющий собой солевой экстракт тканей, содержащий ТФ и фосфолипиды клеточных мембран.

Завершает процесс свертывания общий путь. Активированный фактор Ха превращает неактивный протромбин в гиперактивный фермент тромбин, тромбин отщепляет от молекулы растворимого фибриногена 4 фибринопептида, оставшиеся мономеры ассоциируют в полимер фибрин, ф. XIII завершает процесс, образуя ковалентные связи внутри молекулы фибрина, что делает молекулу нерастворимой и резистентной к лизису.

7

Фибриновый сгусток, образовавшийся в результате свертывания крови, в дальнейшем, после исчезновения риска кровотечения, подвергается лизису под влиянием ферментов фибринолитической системы крови.

В таблице 1 представлены основные плазменные факторы системы гемостаза.

Таблица 1 (по Долгову В.В. и Свирину П.В., 2005)

Плазменные факторы свертывания крови

При разработке первой номенклатуры тканевому фактору был придан символ «фактор III», а ионам кальция, участвующим в свертывании – символ «фактор IV». В настоящее время римская нумерация для них не используется, т.к. тканевый фактор не относится к плазменным белкам, а ионы кальция также не белки. Символом «фактор IV» был ошибочно назван фактор Va, и он также не употребляется.

РОЛЬ ЭНДОТЕЛИЯ В СИСТЕМЕ ГЕМОСТАЗА

Структурная организация эндотелия обеспечивает поддержание целостности сосудистой стенки и избирательную проницаемость для различных субстанций. Обладая плюрипотентной функцией, эндотелий проявляет как антикоагулянтные, так и прокоагулянтные свойства, принимая участие в прокоагулянтном ответе.

Антитромботическое состояние эндотелия обеспечивается как секретируемыми, так и мембран-связанными субстанциями. Секретируются: простациклин (ингибирует активацию тромбоцитов), оксид азота (ингибирует активацию тромбоцитов), тканевый активатор плазминогена (t-PA – tissue Plasminogen Activator), полипептид TFPI (tissue factor pathway inhibitor), ингибирующий фактор Ха.

Связанные с мембранами субстанции – это АТФаза (ингибирует выделение АДФ из тромбоцитов), тромбомодулин (связывает тромбин, ингибируя активацию тромбоцитов), гепарин (инактивирует тромбин).

Прокоагулянтная активность эндотелия появляется при повреждении эндотелиального слоя механическими или химическими агентами, бактериальным эндотоксином, тромбином, активацией комплемента, инфекцией и др.

У стимулированных эндотелиальных клеток появляются прокоагулянтные и противовоспалительные свойства:

-экспонирование на поверхности ТФ,

-снижение количества тромбомодулина,

-синтез ингибитора активатора плазминогена PAI-1 (Plasminogen Activator Inhibitor 1),

8

-высвобождение ф. Виллебранда,

-изменение фосфолипидного состава наружной поверхности мембран эндотелиоцитов с появлением рецепторов для ферментных комплексов коагуляционного каскада.

Гемостатическая активность артерий, вен и капилляров существенно различается. Прокоагулянтная активность доминирует в артериях, а антикоагулянтная – в микроциркуляции, препятствуя образованию тромбов.

В ответ на повреждение сосудистой стенки в течение нескольких секунд под влиянием эндотелина (пептидного гормона из группы цитокинов) происходит сокращение поврежденного

èсоседних участков сосуда, кровоток частично перекрывается.

Важнейшую роль в активации свертывания играет субэндотелий, содержащий разные типы коллагена, фибронектин, витронектин, ламинин, протеогликаны, гликозаминогликаны, тромбоспондин, фактор Виллебранда. Субэндотелий является стимулятором адгезии тромбоцитов и активатором каскадной системы свертывания. Прокоагулянтные свойства клеток субэндотелия (макрофагов, фибробластов, лейкоцитов, гладких мышечных клеток) обусловлены наличием на их поверхности ТФ.

Коллаген является субстратом для адгезии и активации тромбоцитов и активатором контактной (внутренней) системы коагуляции. Известно 12 вариантов коллагена. Типы I, III, IV и V коллагена активируют тромбоциты, воздействуя непосредственно на тромбоцитарные рецепторы или опосредованно через ф. Виллебранда, что вызывает изменение формы тромбоцитов, их адгезию и дегрануляцию.

ТРОМБОЦИТЫ

Тромбоциты, или кровяные пластинки, представляют собой безъядерные дискообразные клетки диаметром 2-3 мкм, основной функцией которых является обеспечение процесса первичного гемостаза в местах повреждения сосудистого русла. Они продуцируются мегакариоцитами костного мозга, откуда выделяются в кровоток и циркулируют около 10 дней.

1/3 всех тромбоцитов находится в селезенке, 2/3 циркулируют в крови. Нормальное содержание тромбоцитов в крови составляет 150-450х109.

Циркулирующие тромбоциты в нормальных условиях не взаимодействуют с внутренней поверхностью сосуда, покрытой атромбогенным пластом эндотелиальных клеток. Однако при повреждении сосудистой стенки в просвет сосуда экспонируются компоненты субэндотелия, главным из которых является коллаген, и тромбоциты при участии ф. Виллебранда быстро адгезируют (прилипают) к поврежденному участку.

Реакцию адгезии опосредуют мембранные белки внешней оболочки (гликокаликса) тромбоцитов, гликопротеиды Ia-IIa и VI, являющиеся рецепторами коллагена, и Ib, являющийся рецептором ф. Виллебранда.

Параллельно процессу адгезии происходит активация тромбоцитов. Среди соединений, которые способны активировать тромбоциты, физиологически наиболее важными являются коллаген, локализованный в субэндотелиальных структурах, АДФ, высвобождающийся из поврежденных клеток, и тромбин, образующийся в участке повреждения в результате инициации каскада свертывания. Веществом, способным инициировать связывание ф. Виллебранда с мембранным гликопротеидом Ib-IX тромбоцитов и таким образом вызывать их агрегацию, является ристоцетин. В тоже время такие соединения, как адреналин, фактор активации тромбоцитов, иммунные комплексы и некоторые др., также могут способствовать активации тромбоцитов.

Вещества, активирующие тромбоциты (агонисты или индукторы), взаимодействуют со специфическими рецепторами на поверхности тромбоцитов и проявляют свое активирующее действие через систему вторичных посредников, стимулируя фосфолипазу С, образование фосфоинозитидов и диацилглицерина, активацию протеинкиназы С и повышение концентрации цитоплазматического кальция. Таким образом, с помощью вторичных посредников происходит передача сигнала внутрь тромбоцита, приводящая к изменениям практически всех внутриклеточных систем кровяных пластинок.

Одной из таких систем является цитоскелет тромбоцитов, в результате перестройки которого происходит изменение дискоидной формы пластинок на сферическую, образование псевдоподий, распластывание адгезированных тромбоцитов и секреция путем экзоцитоза содержимого бетагранул (низкомолекулярные соединения: АДФ, серотонин, Са2+ и др.) и aльфа-гранул (белки: фибриноген, ф.V, ф. Виллебранда, бета-тромбоглобулин, 4-ый пластиночный фактор и др.). Повышение внутриклеточного Са2+ приводит к активации Са2+- зависимой фосфолипазы А2, отщеплению от мембранных фосфолипидов арахидоновой кислоты и последующему образованию из нее тромбоксана А2 при участии ферментов циклооксигеназы и тромбоксансинтетазы.

Секретируемые из активированных тромбоцитов АДФ и тромбоксан А2, по принципу положительной обратной связи, способствуют дальнейшему усилению активации и вовлечению

9

в процесс новых циркулирующих тромбоцитов. Одним из важнейших следствий активации тромбоцитов является модификация комплекса мембранных гликопротеидов IIb-IIIa, который в результате конформационных изменений приобретает способность к связыванию фибриногена. В результате этого фибриноген, взаимодействующий с гликопротеидами IIb-IIIa, образует “мостики” между активированными тромбоцитами и, таким образом, происходит склеивание или агрегация кровяных пластинок, завершающаяся формированием в зоне повреждения сосудистой стенки тромбоцитарного, или белого, тромба.

Активированные тромбоциты принимают также участие в образовании фибринового сгустка, ускоряя работу коагуляционного каскада. Катализатором реакций свертывания крови является 3-й пластиночный фактор, представляющий собой фосфолипиды, появляющиеся на поверхности активированных тромбоцитов.

Тромбоциты не только выступают в качестве главных участников процесса тромбообразования, но также оказывают существенное влияние на другие звенья гемокоагуляции, обеспечивая активирование фосфолипидных поверхностей, необходимых для реализации процессов плазменного гемостаза, высвобождая в кровь ряд факторов св¸ртывания, модулируя фибринолиз и нарушая гемодинамические константы как пут¸м транзиторной вазоконстрикции, обусловленной генерацией тромбоксана А2, так и пут¸м образования и выделения митогенных факторов, способствующих гиперплазии сосудистой стенки.

Нарушение функций тромбоцитов приводит к развитию геморрагического синдрома, являющегося главным клиническим проявлением наследственных тромбоцитопатий (тромбастения Гланцманна, синдром Бернара-Сулье, синдром Аахуса, синдром «серых» тромбоцитов, синдром Вискотта-Олдрича и др.). В этих наследственных заболеваниях и синдромах доминирующую роль играют генетические изменения функциональных и/или структурных свойств тромбоцитов.

Приобретенные тромбоцитопатии являются причиной кровоточивости «невыясненного генеза»

èвстречаются при гемобластозах, лучевой болезни, почечной недостаточности, ДВС-синдроме, инфекционных заболеваниях, при приеме ряда лекарств (аспирин, хинин и др.).

Для диагностики подавляющего большинства наследственных и приобретенных тромбоцитопатий достаточно исследования агрегационной активности тромбоцитов с использованием трех индукторов: АДФ, коллагена и ристоцетина, т.к. среди соединений, которые способны активировать тромбоциты in vitro, наиболее важными являются коллаген, локализованный в субэндотелиальных структурах,

èАДФ, высвобождающийся из поврежденных клеток. Веществом, способным инициировать связывание ф. Виллебранда с мембранным гликопротеином Ib-IX тромбоцитов и таким образом вызывать их агрегацию, также является ристоцетин.

ПЛАЗМЕННЫЙ ГЕМОСТАЗ

Плазменный (коагуляционный) гемостаз представляет собой каскад реакций, в которых участвуют факторы св¸ртывания крови, завершающийся процессом образования фибрина. Образовавшийся фибрин подвергается далее разрушению под влиянием плазмина (фибринолиз).

На основании функциональных и структурных характеристик факторы свертывания могут быть сгруппированы следующим образом:

1.Сывороточные протеазы – энзимы

·витамин К зависимые: II, VII, IX, X

·система контакта: XI, XII, прекалликреин

2.Трансамидазы: XIII

3.Кофакторы:

·плазмы: V, VIII, высокомолекулярный кининоген, фибриноген

·тканей: тканевый фактор

Ферменты контактной системы синтезируются в печени, не зависят от витамина К. Факторы II, VII, IX, X также синтезируются в печени, но их участие в процессе свертывания

зависит от присутствия витамина К, без которого они не могут связываться с фосфолипидной поверхностью.

Ф. XIII – трансамидаза, которая катализирует образование ионовалентных связей между мономерами фибрина, синтезируется в печени, не зависит от витамина К.

Кофакторы не являются ферментами, но являются белками, ускоряющими в 1000-10000 раз взаимодействие между активными ферментами и их субстратами, синтезируются в печени.

10