6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторные_методы_исследования_системы_гемостаза_и_диагностика

ВНУТРЕННИЙ ПУТЬ СВЕРТЫВАНИЯ

По внутреннему (контактному) пути св¸ртывание крови инициируется без участия тканевого тромбопластина; в нем принимают участие факторы плазмы (XII, XI, IX, VIII, X), калликреинкининовая система и тромбоциты.

Процесс внутреннего свертывания начинается с активации «факторов контакта»: ф. XII (Хагемана), прекалликреина и высокомолекулярного кининогена, которые связываются с коллагеном базальной мембраны эндотелия или с отрицательно заряженной чужеродной поверхностью, образуют комплекс и взаимно активируют друг друга, что выражается в изменении молекулярной структуры каждого компонента. При этом прекалликреин (ф. Флетчера) под влиянием своего кофактора - высокомолекулярного кининогена (ф. Фицджеральда) превращается в калликреин, неактивный фактор XII (ф. Хагемана) – в ф. XIIa. Активный ф. XIIа превращает ф. XI в ф. XIa, который в свою очередь воздействует на ф. IX, переводя его в ф. IXa.

Ф. IXa, вместе со своим кофактором ф. VIIIa, фосфолипидами и ионами кальция образуют комплекс ТЕНАЗУ, который активирует ф. Х и запускает процесс свертывания крови по общему пути.

В общем пути ф. Xa в присутствии кофактора ф. Va превращает протромбин в тромбин. Эти взаимодействия также осуществляются на фосфолипидной мембране в присутствии ионов кальция, образуя комплекс ПРОТРОМБИНАЗУ, который состоит из факторов Xa, Va (кофактор) и II и ведет к быстрому образованию тромбина.

Тромбин превращает растворимый фибриноген плазмы крови в нерастворимый фибрин. Под действием ф. XIII происходит полимеризация фибрина.

Для моделирования in vitro внутреннего пути свертывания служит тест определения активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ).

Тест используют для выявления широкого спектра коагуляционных нарушений:

-для исследования причины кровотечения или тромбозов;

-для диагностики гемофилии;

-при исследовании причин патологии беременности;

-для мониторинга антикоагулянтной терапии, в том числе гепаринотерапии;

-для выявления диссеминированного внутрисосудистого свертывания;

-для обнаружения дефицита отдельных факторов свертывания крови;

-для обнаружения специфических ингибиторов свертывания (например, к ф. VIII);

-для выявления неспецифических ингибиторов свертывания (волчаночный антикоагулянт);

-перед хирургическим вмешательством для исследования опасности кровотечения;

-для выявления заболеваний печени.

Метод моделирования процесса внутреннего свертывания в системе in vitro первоначально осуществляли на стеклянной поверхности. Однако стекло активировало процесс по-разному в зависимости от марки, методов обработки, применяемого моющего средства. С целью стандартизации в качестве активатора (отрицательно заряженной поверхности) стали использовать каолин, целит, бентонит и ряд других веществ с отрицательно заряженной поверхностью, в последние годы – растворимую в воде эллаговую кислоту. При проведении теста используют также фосфолипиды растительного и животного происхождения или их смесь и ионы кальция для рекальцификации плазмы после действия цитрата. С целью стандартизации реакцию проводят при постоянной температуре (37°С).

Тест называется частичным, т.к. в нем принимает участие «частичный тромбопластин» - кефалин (фосфолипидный экстракт из головного мозга или из мембран эритроцитов), а не полный тромбопластин, включающий ТФ.

До настоящего времени в ряде лабораторий проводят 2 других аналогичных, но лишь частично стандартизированных теста:

ЧТВ (частичное тромбопластиновое время или кефалиновое время) и АВР (активированное время рекальцификации или каолиновое время).

ЧТВ, кефалиновое время, определяют при добавлении в исследуемую плазму фосфолипидного компонента (кефалина) и кальция хлористого.

АВР, коалиновое время, определяют при добавлении в исследуемую плазму ф. контакта (каолина) и кальция хлористого, тест чувствителен к волчаночному антикоагулянту.

Тест АЧТВ до настоящего времени не стандартизован ВОЗ, так как для его проведения применяют различные реагенты. В качестве заменителя тромбоцитарного ф. 3 используют тромбоциты, фосфолипиды животного происхождения (мозг кроликов, быка или человека), растительные фосфолипиды (сои), смесь растительных и животных фосфолипидов, фосфолипиды из мембран эритроцитов человека: эрилид, эритрофосфатид. АЧТВ-реагенты различаются также

11

по типу и концентрации активатора, типу буфера, присутствию защитных добавок. Было установлено, что именно фосфолипидные реагенты являются тем компонентом, который преимущественно влияет на результаты АЧТВ-теста, и оптимальными являются те реагенты, в которых соотношение фосфатидил-серина и фосфатидил-холина такое же, как в факторе 3 тромбоцитов.

ВНЕШНИЙ ПУТЬ СВЕРТЫВАНИЯ

Внешний путь образования протромбиназы короткий, что ведет к быстрому образованию тромбина. При контакте ТФ и ф. VIIа формируется комплекс, который активирует фактор Х. Фактор Ха при участии своего кофактора ф. Va в присутствии ионов кальция на отрицательно заряженной поверхности формирует комплекс ПРОТРОМБИНАЗУ, который превращает неактивный протромбин в главный фермент коагуляции - тромбин.

ТФ является интегральным мембранным рецептором для факторов VII-VIIa и принадлежит к семейству интерферон-цитокиновых рецепторов. В нормальных условиях ТФ не экспонирован на поверхности клеток (эндотелиоцитов и лейкоцитов), контактирующих с кровью. ТФ обнаружен на фибробластах и перицитах под эндотелиальной поверхностью, в мозгу, кардиальных миоцитах и в почечных клубочках, в эндотелиоцитах желудочно-кишечного и респираторного отделов. ТФ обеспечивает гемостатическую оболочку кровеносных сосудов и внутренних органов. Экспрессия ТФ возникает под действием различных агонистов (бактериальный эндотоксин, цитокины, сепсис, травма).

Внешний путь свертывания принято in vitro моделировать тестом протромбинового времени. Протромбиновый тест был предложен в 1935 г. А.Quick с целью определения в системе in vitro активность протромбина – ф. II свертывания крови.

Позднее было установлено, что этим тестом определяется активность нескольких факторов свертывания крови (факторов протромбинового комплекса): ф. II (протромбин), ф. VII (проконвертин),

ô.X (Стюарта) и ф. V (проакселерин). Для проведения теста требуется ТФ, фосфолипиды и ионы кальция.

Солевые экстракты тканей (легкие, плацента, головной мозг) животных и человека, богатые ТФ, называют тромбопластинами. Концентрация ТФ в этих реагентах так велика, что активация

ô.Х с ними происходит буквально за несколько секунд.

Ô.VIIa, главный фактор внешней системы коагуляции, циркулирует в крови в активной форме, но не проявляет своей активности до контакта с ТФ. В норме ТФ содержится только на клетках, которые не находятся в прямом контакте с кровотоком, и поэтому могут вызывать свертывание крови только после повреждения сосудов. При этом образуется двумолекулярный комплекс, который и проявляет активность ф. VIIa.

ÌÈ× è ÌÍÎ

В настоящее время не подлежит сомнению эффективность применения в медицинской практике пероральных антикоагулянтов - антагонистов витамина К при лечении венозных тромбозов и тромбоэмболий легочной артерии. К пероральным антикоагулянтам относят производные индадиона (фенилин) и кумарина (варфарин). Эти препараты с успехом используют для предупреждения тромбоэмболических осложнений любого генеза. Доказана их эффективность и для предупреждения тромбоэмболических осложнений при имплантации искусственных клапанов сердца, так как у больных этой категории повышен риск эмболий, приводящих к инсульту, причем особенно высока частота эмболических осложнений у больных инфарктом миокарда. В отличие от других лекарственных средств, тормозящих формирование фибрина (гепарин, дефибринаторы), пероральные антикоагулянты препятствуют образованию в гепатоцитах полноценных в коагуляционном отношении факторов II, VII, IX и X, вызывая состояние гипокоагуляции. Противотромботическое действие считается полноценным, когда снижается концентрация всех четырех факторов свертывания.

Трудности при лечении пероральными антикоагулянтами заключаются в необходимости выбора такой оптимальной дозы препарата, которая обеспечивала бы предотвращение тромбообразования, не вызывая при этом кровотечения. На протяжении всего периода клинического применения непрямых антикоагулянтов основным методом контроля является определение продолжительности протромбинового времени (ПВ) по методу Quick. В мире используется около 30 тромбопластинов, которые получают из разных источников (кадаверный мозг человека, мозг быка, кролика или плацента человека), а также рекомбинантные реагенты. Тромбопластины варьируют по чувствительности к угнетению витамин-К зависимых факторов свертывания под действием кумариновых антикоагулянтов. Имеет значение и источник получения, и способ приготовления. Особенно варьируют тромбопластины по чувствительности к ф. VII. Мало чувствительный реагент «не чувствует» снижения активности факторов свертывания, время свертывания (ПВ)

12

почти не изменяется. Даже реагенты, приготовленные из одной ткани, варьируют по чувствительности к дефектам свертывания, вызванным пероральными антикоагулянтами.

Трудности возникают также при интерпретации полученных результатов. ПВ выражают поразному:

-в секундах, по сравнению с нормой,

-как протромбиновое отношение (ПО), отношение ПВ больного к ПВ нормы;

определенная по калибровочному графику разведений нормальной плазмы (процент протромбина по Квику).

Попытки стандартизации основывались на 3 основаниях:

-использование единой схемы тестирования и представления результатов;

-калибровка тромбопластинов по стандартному реагенту;

-использование стандартной плазмы.

Большинство экспертов склонились к мысли, что стандартизация должна основываться на тромбопластинах. Это легло в основу международной стандартизации ВОЗ.

Метод стандартизации тромбопластинов был разработан в результате исследований 10 центров под эгидой Бюро Европейского Содружества по эталонам и Международного комитета по стандартизации в гематологии. Было изготовлено 3 эталона тромбопластина: ВСТ/099 (human plain), ОВТ/79 (bovine combined), RBT/79 (rabbit plain). Термин «plain» означает, что тромбопластин является простым экстрактом тканей, без добавок. Термин «combined» означает, что тромбопластин содержит добавки (фибриноген, ф. V, кальций хлористый).

Стандартизация тромбопластинов стала возможной после того, как был разработан способ сопоставления разных тромбопластинов с использованием метода определения Международного Индекса Чувствительности (МИЧ) (International Sensitivity Index – ISI).

Согласно этому методу точки на графике, соответствующие значениям протромбинового времени (ПВ) для двух тромбопластинов, полученные при анализе проб плазмы с разной активностью протромбина, лежат на прямой линии, проходящей через начало координат двойной логарифмической шкалы. Наклон полученной прямой является МИЧ.

Калибровки тромбопластинов была сведена к следующему. Измеряется ПВ в нормальной (2 точки) и кумариновой (6 точек) плазме, с использованием эталонного и калибруемого тромбопластинов. ПВ откладывают на двойной логарифмической шкале, причем на вертикальной оси откладывают ПВ, полученное с эталоном, на горизонтальной – ПВ, полученное с исследуемым тромбопластином. Проводят калибровочный график и математическим методом ортогональной регрессии определяют наклон полученной прямой линии, который и характеризует МИЧ. Эта модель калибровки была официально принята ВОЗ в 1983 г. Были введены следующие термины:

-Международный индекс чувствительности – ÌÈ×-(International Sensitivity Index – ISI).

-Международное нормализованное соотношение – ÌÍÎ-(International Normalized ratio – INR)

–это протромбиновое отношение (ПО), полученное с эталоном тромбопластина, имеющего МИЧ = 1,0.

При возведении значения ПО в степень МИЧ будет получено то значение МНО, которое было бы получено для данной плазмы с использованием Международного эталонного препарата тромбопластина:

ÌÍÎ = ÏÎ ÌÈ×

Имеется обратная зависимость между чувствительностью тромбопластина и МИЧ. Чем меньше МИЧ, тем выше чувствительность реагента. По теории любой реагент может быть использован при определении МНО, если известен МИЧ. Однако на практике показано, что лучше использовать чувствительные реагенты с МИЧ около 1,0, т.к. даже небольшое изменение ПВ отражается на МНО, если использован нечувствительный реагент. В США рекомендовано использовать реагенты с МИЧ не ниже 1,5, а лучше – не ниже 1,2.

Система калибровки ВОЗ была создана для ручного метода. Однако в развитых странах ПВ определяют на коагулометрах, которые также влияют на ПВ. Показано, что МИЧ различается в зависимости от способа регистрации конечной точки реакции. Один и тот же реагент может иметь разные МИЧ для разных коагулометров. Разница в МИЧ для ручного и приборного методов может составлять до 10%.

13

Расчет МНО позволяет клиницисту использовать в работе таблицы соответствия МНО и необходимого и достаточного уровня антикоагулянтной терапии. Так при лечении тромбозов глубоких вен, легочной эмболии и инфаркта миокарда рекомендуемая терапевтическая область МНО составляет 2,0-3,0, а при искусственных клапанах сердца 3,0 – 4,5.

Âнастоящее время в связи с распространением ВИЧ и вирусов гепатита использование тромбопластинов из кадаверного мозга запрещено и разработаны рекомбинантный эталон тромбопластина (rTF/95) и эталон из мозговой ткани кролика – RBT/90, оба реагента с МИЧ 1,0.

Обращаем внимание на недопустимость смешивания понятия «активность» и «чувствительность» тромбопластинов. Активность – это протромбиновое время (сек) в нормальной плазме, чем оно короче, тем тромбопластин «активнее». Однако в данном случае важнее понятие «чувствительность», которое означает, что данный реагент хорошо «чувствует» снижение уровня факторов протромбинового комплекса.

Âнастоящее время в России тромбопластины с аттестованным МИЧ выпускают НПО «РЕНАМ» МБООИ «Общество больных гемофилией», Москва, и ООО «Технология-Стандарт», Барнаул.

Âряде стран (в том числе в США) получил распространение другой, более простой способ представления результатов определения протромбинового времени, предложенный в свое время еще Квиком и получивший название “активность протромбина по Квику”. При использовании этого метода строится калибровочный график зависимости протромбинового времени от суммарной активности факторов протромбинового комплекса в разведенных растворах нормальной плазмы.

Âнеразведенной свежей плазме активность факторов протромбинового комплекса принимается за 100%. При тестировании исследуемой плазмы больного прямо по калибровочной кривой определяют “процент протромбина по Квику”. У здоровых доноров процент протромбина по Квику колеблется от 70 до 120%, у больных снижается до 25%.

Âнашей стране было принято определять протромбиновый индекс - процентное отношение протромбинового времени здорового человека к протромбиновому времени больного, т.е. вычислять значение, обратное общепринятому за рубежом. При этом совершенно не принимают во внимание чувствительность используемого для анализа тромбопластина. Метод определения протромбинового индекса в настоящее время считается устаревшим и не несущим необходимой информации, однако в нашей стране этот метод еще пользуется спросом.

КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФАКТОРОВ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ Фактор I

Ô.I плазмы крови фибриноген является уникальным, т.к. он способен быстро полимеризоваться

âкрови и образовывать прочную структуру, которая эффективно закрывает повреждение сосуда и препятствует потере крови. В связи с такой важной ролью содержание фибриногена

âплазме крови выше, чем других факторов.

Синтез фибриногена происходит в печени и не зависит от витамина К.

Фибриноген – это большой многокомпонентный белок, который состоит из 3 пар полипептидных цепей - 2-альфа, 2-бета, 2-гамма, связанных 29 дисульфидными связями.

Процесс взаимодействия фибриногена и тромбина происходит в кровотоке. Тромбин соединяется с фибриногеном и отщепляет конечные последовательности от 2-альфа и 2-бета цепей, образуя 2 фибринопептида А и 2 фибринопептида В. Комплиментарные участки оставшихся фибринмономеров начинают соединяться, образуя димеры, олигомеры и т.д. до образования растворимого фибрин-полимера. Одновременно тромбин активирует фактор XIII, который сшивает ковалентными связями гамма-цепи растворимого полимера фибрина, делая молекулу нерастворимой. Образовавшийся фибриновый сгусток должен содержать тромбоциты, эритроциты и лейкоциты. Активированные тромбоциты сокращаются под действием тромбоцитарного актомиозина – тромбостенина и происходит уплотнение сгустка. Окончательно тромб формируется на 10-15 мин после начала полимеризации фибрина. Если тромбоциты отсутствуют, то сгусток быстро лизируется под влиянием фибринолиза.

В результате увеличения концентрации фибриногена в крови резко повышаются СОЭ и вязкость крови, но не усиливается гемокоагуляция.

Только из-за значительного недостатка фибриногена А (гипофибриногенемия), когда его количество ниже 1 г/л, могут возникнуть кровотечения.

Гипо - и афибриногенемия (полное отсутствие фибриногена в крови) бывают врожденными и приобретенными. Встречается и дисфибриногенемия — состояние, когда под действием тромбина фибриноген крови не превращается в фибрин вследствие функциональной неполноценности молекулы фибриногена. Приобретенные гипо- и афибриногенемии особенно часто выявляют акушеры и хирурги у больных с развивающимся острым ДВС-синдромом, реже возникновение фибриногенопении связано с тяжелым нарушением функции печени.

14

Промежуточные продукты реакции превращения фибриногена в фибрин - фибринопептиды иногда появляются в циркулирующей крови, что свидетельствует либо о ранних этапах развития ДВС, либо о латентно протекающем внутрисосудистом свертывании крови в нормальных условиях. Образовавшийся фибрин легко растворяется фибринолизином и потому не может обеспечить полноценный гемостаз. Это нередко бывает причиной кровоточивости и плохого заживления ран. Подобный фибрин называется растворимым (фибрин S, soluble). Полноценным, то есть устойчивым к фибринолизину, фибрин становится под действием фибриназы (фибринстабилизирующего ф. XIIIa). Образовавшийся фибрин называется нерастворимым фибрином (фибрин I, insoluble).

Генетические нарушения структуры молекулы фибриногена, фибринопатии проявляются тромбозами или кровоточивостью, или не имеют клинических проявлений, обнаруживаются с помощью теста тромбиновое время, АЧТВ, обнаружения продуктов деградации фибриногена/ фибрина и выявления генетического дефекта у родственников.

Фибриноген имеет много функций: принимает участие, как в свертывании крови, так и в агрегации тромбоцитов, определяет вязкость крови и влияет на взаимодействие форменных элементов крови с сосудистой стенкой. Фибриноген – это белок острой фазы, его концентрация увеличивается при острых ситуациях: травме, инфекции, воспалении, операции и т.п.

Концентрация фибриногена возрастает с возрастом, а также при ожирении, у больных атеросклерозом, сахарным диабетом, у курящих, при инфаркте миокарда, канцерогенезе, нефрозе.

Возрастание в крови содержания фибриногена приводит к риску возникновения атеросклероза коронарных, мозговых и внемозговых артерий и к увеличению смертности.

Все вышесказанное свидетельствует о необходимости точного определения содержания фибриногена в плазме крови. Лучшим методом исследования фибриногена в настоящее время является метод Клаусса.

Фактор II

Ô.II — протромбин — относится к эуглобулинам. Под действием протромбиназы он превращается в альфа-, бета- и гамма-тромбины.

Сериновая протеаза альфа-тромбин обладает сильной свертывающей активностью в отношении фибриногена, но быстро нейтрализуется антитромбином III.

бета-тромбин резистентен по отношению к гепарину и антитромбину III.

гамма-тромбин не имеет свертывающей активности, но ему присуще эстеразное и фибринолитическое действие.

Ô.II cинтезируется в печени при участии витамина К. Если нарушается функция печени, концентрация протромбина в крови снижается.

Уровень протромбина, или его функция, снижается при эндоили экзогенной недостаточности витамина К, когда синтезируется неполноценный протромбин.

Скорость свертывания крови нарушается лишь при уменьшении концентрации протромбина ниже 40 %.

Повышенный уровень ф. II способствует развитию тромбозов. Как правило, гиперпротромбинемия остается фактором риска, если появляется активная протромбиназа, снижаются активность антитромбина III и гепарина, а также угнетен фибринолиз.

Превращение протромбина в тромбин путем последовательного протеолиза 2 связей происходит на высокомолекулярном комплексе ПРОТРОМБИНАЗЕ, образованным анионными фосфолипидными поверхностями, ионами кальция и ф. Va (кофактор) и Xa.

Образуется несколько активных структур с уменьшающейся молекулярной массой: мезотромбин, альфа-тромбин, бета-тромбин, гамма-тромбин. Наиболее важным продуктом является сериновая протеаза альфа-тромбин.

На молекуле тромбина есть 4 области связывания с кальцием, с субстратами, ингибиторами

èкофакторами. Тромбин активен не только на твердой фазе, но и в токе крови и выполняет многочисленные функции:

- Протеолиз фибриногена до фибрин-мономеров. - Активация факторов V, VIII, VII, XI.

- Активация тромбоцитов.

- Активация протеина С в комплексе с тромбомодулином. - Активация ф. XIII.

- Участие в образовании ингибитора фибринолиза TAFI.

- Стимуляция выброса из эндотелиоцитов тканевого активатора плазминогена. Главный ингибитор тромбина – антитромбин III.

15

Фактор V

Ô.V – это одноцепочечный гликопротеин, который находится в плазме и в альфа-гранулах тромбоцитов, является кофактором ф. Xa, структурно и функционально близок с ф. VIII, синтезируется в печени, в мегакариоцитах и в лимфоцитах.

Связанный с мембранами ф. Vа функционирует как рецептор для ф. Xa, с которым в присутствии кальция они образуют ПРОТРОМБИНАЗУ.

Ô.Va инактивируется активированным протеином С.

Ô.V лабильный, плохо сохраняется в консервированной крови. Во время свертывания крови фактор потребляется, как и фактор II, поэтому в сыворотке не обнаруживается. В случаях дефицита ф. V в различной степени нарушаются внешний и внутренний пути образования протромбиназы. В коагулограмме это, прежде всего, выражается удлинением протромбинового времени. Тромбиновое время остается в пределах нормы.

Протеин С, ингибитор ф. Ха, в процессе ингибирования соединяется с фактором Vа и занимает место ф. Ха, цепи ф. Vа расщепляются и часть уходит, а часть остается, мешая приходу новых молекул ф. Vа, процесс свертывания удлиняется.

Имеется врожденная мутация гена ф. V, при которой протеин С не может расщепить молекулу ф. Vа, свертывание не удлиняется. Измененный ф. V получил название ф. V Лейден, его наличие повышает риск тромбозов.

Фактор VII

Ô.VII – проконвертин, или конвертин, - синтезируется в печени при участии витамина К. Долго остается в стабилизированной крови, хорошо переносит нагревание, поэтому называется стабильным фактором.

Ô.VII является стержневым в инициации внешнего пути свертывания вместе со своим кофактором – ТФ. Повышенный уровень ф. VII коррелирует с высоким содержанием жиров в диете и является фактором развития ишемических кардиоваскулярных осложнений. Ф. VII – сериновая протеаза, активирует факторы IX и X, для этого требуются фосфолипиды, кальций и ТФ.

У больных с поражением печени и у подвергаемых лечению антикоагулянтами непрямого действия активность ф. VII снижается. Врожденным недостатком ф. VII обусловлено развитие геморрагического диатеза (болезни Александера).

Фактор VIII

Ô.VIII, гликопротеин, циркулирует в плазме крови человека в неактивной форме в комплексе

ñмультимерным белком-носителем – фактором Виллебранда. Под влиянием тромбина или ф. Xa фактор VIII диссоциирует от ф. Виллебранда и переходит в активную форму VIIIa.

Функция ф. VIIIа заключается в том, что в качестве кофактора ф. IXа он активирует ф. X и многократно ускоряет процесс свертывания плазмы крови.

Ген, регулирующий синтез ф. VIII, подвержен частым мутациям, что приводит к образованию функционально неполноценного ф VIII и к возникновению тяжелого наследственного заболевания

– гемофилии А, которая встречается у 1 из 10000 мужчин. Заболевание характеризуется спонтанными, нередко смертельными кровотечениями, кровоизлияниями в суставы, ведущими к ранней инвалидности. Уже при снижении ф. VIII до 30% (норма – 50-200%) заболевание проявляется в скрытой форме и обнаруживается после оперативных вмешательств в виде профузных кровотечений. Эти больные в течение всей жизни нуждаются в заместительной терапии препаратами плазмы.

Гемофилия А расценивается:

- как тяжелая - при уровне ф. VIII в пределах 0-1%;

- средней тяжести - при уровне ф. VIII в пределах 1-5%; - легкая - при уровне ф. VIII в пределах 5-24%;

- скрытая – при уровне ф. VIII в пределах 24-49%.

В качестве антигемофильных лекарственных средств применяют криопреципитат, свежезамороженную плазму и различные концентраты ф. VIII, полученные из криопреципитата или генно-инженерными методами.

Очевидно, что для достоверной диагностики гемофилии и при лечении больных чрезвычайно большое значение приобретает метод определения активности ф. VIII в плазме крови пациентов.

Наиболее простой и наиболее широко распространенный одностадийный метод основан на проведении теста АЧТВ.

За Международную единицу биологической активности ф. VIII принята активность, присутствующая в 1,0 мл свежей нормальной плазмы. Основная трудность такого выражения активности – это большая вариабельность активности ф. VIII в нормальной популяции.

16

Разработка коммерческих препаратов концентрата ф. VIII привела к необходимости создания эталона, относительно которого коммерческие препараты также могли быть стандартизованы.

Первый международный стандарт ф. VIII был создан в 1971 г. Этот стандарт был препаратом концентрата ф. VIII средней степени очистки и был предназначен для калибровки коммерческих препаратов. Впоследствии этот стандарт несколько раз видоизменялся в зависимости от разработки новых методов очистки, и последний (88/804) был создан на основе технологии моноклональных антител.

Фактор Виллебранда

Эрих Адольф фон Виллебранд (1870-1949) в 1926 г. впервые описал «наследственную псевдогемофилию», которой страдали 10 из 13 членов одной семьи. Неукротимое кровотечение из любых ран, при удалении зубов, при менструации – вот типичные признаки болезни, описанной Виллебрандом. Но лишь в 1970-1971 гг. был открыт фактор, названный в честь Виллебранда. Этот фактор был описан и изучен позднее – в 1989-1990 гг. Было установлено, что болезнь Виллебранда связана с нарушением структуры и функции особого плазменного белка – ф. Виллебранда, который осуществляет 2 функции: способствует адгезии тромбоцитов и образованию тромба в месте повреждения сосуда, а также образует комплекс с антигемофильным ф. VIII.

Ф. Виллебранда – это гликопротеин, имеющий мультимерную структуру и состоящий из варьирующего числа субъединиц (от 2 до 100). Это самый крупный растворимый белок плазмы крови. Синтез ф. Виллебранда происходит в гранулах эндотелия и в мегакариоцитах и выделяется из гранул в ответ на различные стимулы.

Диагностика болезни Виллебранда представляет большие трудности, что обусловлено сложностью структуры этого белка и его гена и большого количества подтипов этого заболевания (более 20).

Фактор Виллебранда циркулирует в крови в виде комплекса с ф. VIII и обеспечивает взаимодействие тромбоцитов с поврежденной поверхностью сосудов. Снижение содержания ф. Виллебранда в плазме крови или отсутствие у него биологической активности является основной причиной болезни Виллебранда, поэтому определение его активности является одним из главных диагностических тестов.

Фактор IX

Ô.IX является пунктом конвергенции двух путей свертывания и активируется в обоих случаях. Врожденный дефицит ф. IX вызывает гемофилию В.

Активация ф. IX происходит в результате протеолиза путем образования промежуточного продукта, не обладающего свертывающей активностью. Функция ф. IXа – активация ф. Х в присутствии ионов кальция, анионных фосфолипидных мембран и кофактора – ф. VIIIа (комплекс ТЕНАЗА).

Ô.IX образуется в печени, поэтому его содержание снижено в крови больных гепатитами, циррозами печени, а также у пациентов, принимающих производные дикумарина и индандиона.

Âпроцессе свертывания крови ф. IX не потребляется и остается в сыворотке еще в более активном состоянии, чем в плазме. Его гемостатический уровень (25%) достаточен для выполнения хирургических вмешательств.

Основной ингибитор – антитромбин III.

Фактор Х

Ô.Х – фактор Стюарта – Прауэра – гликопротеин с массой 54200—56000. Вырабатывается

âпечени в неактивном состоянии при участии витамина К и состоит из двух полипептидных цепей: тяжелой (с молекулярной массой 38000), на которой находится активный центр, и легкой

— с остатком карбоксиглютаминовой кислоты, необходимой для присоединения к фосфолипидам. Быстро денатурируется при температуре 56 °С. В консервированной крови при 4 °С сохраняется 2 мес. Для обеспечения гемостаза достаточно 10 % ф. X. Уровень ф. Х в крови связан с протромбиновым временем. Так, если в крови ф. Х менее 1 %, то протромбиновое время будет более 90 сек (при норме 12—14 сек), если от 1 до 2 % — около 70—90 сек, если же от 2 до 5 % — 40—70 сек, а если от 5 до 10 % — 15—40 сек.

Для приобретенного или врожденного недостатка ф. Х характерно удлинение протромбинового времени. Вследствие врожденного недостатка ф. X, наследуемого по неполному аутосомному типу, возникает болезнь Стюарта — Прауэра, которая встречается как у мужчин, так и у женщин. Наклонность к кровоточивости определяется только у гомозиготных особей. Содержание ф. Х снижено в крови больных системным амилоидозом, миеломной болезнью, туберкулезом, с поражениями печени, недостатком витамина К, получающих непрямые антикоагулянты.

Ô.Х активируется также обоими путями. Ф. Ха активирует протромбин на комплексе ПРОТРОМБИНАЗА, содержащим кофактор – ф. Vа, ионы кальция и анионные фосфолипиды.

17

Фактор XI

Ф. XI – гликопротеин с массой молекулы 160 000, термолабилен, разрушается при температуре 56 °С, в процессе свертывания крови не потребляется, поэтому обнаруживается в большом количестве в сыворотке. Активная форма ф. ХIа образуется при участии факторов ХIIа, Флетчера и Фитцжеральда. Ф. ХIа активирует ф. IX, который превращается в ф. IХа. Эта реакция осуществляется и трипсином в присутствии ионов кальция.

Врожденная недостаточность ф. XI наследуется по аутосомно-рецессивному типу. Эта недостаточность выявляется у мужчин и женщин. Кровоточивость в основном отмечается после травм и операций.

Фактор XII

Ô.XII — фактор контакта Хагемана — белок с массой молекулы 80 000. Хорошо сохраняется

âконсервированной крови. При 4°С половина ф. Хагемана остается в крови более месяца. Фактор XII вырабатывается в неактивном состоянии. Место его синтеза не известно. В лабораторных условиях активируется при соприкосновении с поверхностью кварца и стекла, каолина, целита, асбеста, углекислого бария; а в организме — при контакте с кожей, волокнами коллагена, хондроитинсерной кислотой, мицеллами насыщенных жирных кислот, бактериальными липополисахаридами, содержащими радикалы жирных кислот, эндотоксином, адреналином и норадреналином.

Ô.Хагемана — “инициатор” внутрисосудистой коагуляции, активирует прекалликреины плазмы, которые превращаются в ферменты калликреины, освобождающие кинины, служит активатором фибринолиза. Калликреин активирует ф. XII в 10 раз сильнее, чем плазмин и ф. ХIа. В жидкой среде ф. Флетчера оказывается наиболее важным активатором ф. Хагемана.

Врожденный дефицит ф. XII наследуется по аутосомно-рецессивному типу. У больных с недостатком ф. XII в коагулограмме резко удлиняется время свертывания крови, время рекальцификации, каолин-кефалиновое время без клинических признаков кровоточивости.

Фактор XIII

Ф. XIII — фибринстабилизирующий фактор, фибриназа, содержится в плазме в концентрации 20–30 мг/л, синтезируется печенью. Менее термостабилен, чем фибриноген. Определяется в сосудистой стенке, тромбоцитах, эритроцитах, почках, легких, мышцах, плаценте. В плазме находится в виде профермента, соединенного с фибриногеном. Ф. XIII, присутствующий в плазме в виде проэнзима, конвертируется в активный энзим на конечном этапе свертывающего каскада под действием тромбина в присутствии ионов Са2+. Активированный ф. XIIIа действует как трансамидаза, переводя водородные связи между двумя фибрин-мономерами в стабильные пептидные связи. Ф. XIIIa является единственным энзимом коагуляционного каскада, в котором активным участком является не серин, а цистеин. Фибринстабилизирующая активность, кроме плазмы, найдена также в тромбоцитах и плаценте.

Снижение уровня ф. XIII наблюдается у больных с врожденным дефицитом, а также как вторичный синдром при тяжелых поражениях печени, при сепсисе, лучевой болезни, после тяжелых операций. Клиническая картина дефицита ф. XIII проявляется в тяжелом геморрагическом синдроме, при этом продолжительность кровотечения может достигать 12 – 36 часов.

В крови здоровых людей его содержится 80—120% (сгусток растворяется за 50—100 сек). 10% фибриназы обеспечивают полноценный гемостаз, 2% этого фактора достаточны для остановки кровотечения.

Активность ф. XIII хорошо сохраняется при минус 20 °С (лиофилизированные препараты теряют около трети активности за 3 недели). При комнатной температуре активность фермента падает в течение 2—3 дней. В результате прогревания плазмы или сыворотки до 60 °С фибриназа инактивируется за 10 мин. В инкубируемых растворах фибриногена при 40 °С фибриназа разрушается в течение 3 ч.

Тромбы, образовавшиеся в присутствии фибриназы, очень медленно подвергаются лизису. Если активность ф. XIII снижается, тромбы очень быстро распадаются, даже когда фибринолитическая активность крови нормальная. Установлено, что снижение активности фибриназы сопровождается уменьшением адгезивности и агрегации кровяных пластинок, и, наоборот – при повышении активности фибриназы эти свойства тромбоцитов повышаются.

У больных с тромбоэмболическими осложнениями, атеросклерозом, у оперированных, родильниц, после введения адреналина, глюкокортикоидов, питуитрина активность фибриназы повышена, а

óбольных С-авитаминозом, лучевой болезнью, лейкозом, циррозами, лимфомой, с ДВС-синдромами,

óперенесших адреналэктомию, после приема непрямых антикоагулянтов ее активность снижена.

18

Прекалликреин (фактор Флетчера)

Прекалликреин плазмы участвует в контактной фазе коагуляции, образовании кининов, фибринолизе, активации системы комплемента и воспалении. Концентрация прекалликреина в плазме составляет 35-45 мкг/мл, циркулирует в виде нековалентного комплекса с высокомолекулярным кининогеном (ВМК).

Дефицит прекалликреина является редкостью и не сопровождается выраженными аномалиями гемостаза. Синтезируется в печени, присутствует в почках, надпочечниках и плаценте.

Активируется ф. XIIа на отрицательно заряженной поверхности и в присутствии кофактора – ВМК и превращается в калликреин.

Калликреин – сериновая протеаза, участвует во многих защитных реакциях: в контактной фазе коагуляции, образовании брадикинина (вазодилятор), активирует нейтрофилы, участвует в фибринолизе.

Высокомолекулярный кининоген (ВМК)

ВМК, ф. Фитцжеральда, является кофактором контактного пути активации, а также предшественником брадикинина. Другая форма кининогена – низкомолекулярный кининоген также может быть источником брадикинина, но не обладает прокоагулянтной активностью. Концентрация в плазме – 80 мкг/мл. Дефицит встречается редко и не проявляется в виде нарушений гемостаза.

ВМК связывает прекалликреин и ф. XI и обеспечивает на анионной поверхности ускорение их активации ф. XIIа.

ОСНОВНЫЕ ФАЗЫ ПЛАЗМЕННОГО ГЕМОСТАЗА

Процесс плазменного гемостаза можно условно разделить на 3 фазы I фаза – образование протромбиназы.

Различают внутренний и внешний пути формирования протромбиназы.

II фаза — образование тромбина. В эту фазу протромбиназа вместе с факторами коагуляции V, VII, X и IV переводит неактивный ф. II (протромбин) в активный ф. IIа — тромбин. Эта фаза продолжается 2-5 сек.

III фаза — образование фибрина. Тромбин отщепляет от молекулы фибриногена по два пептида А и В, переводя его в фибрин-мономер. Молекулы последнего полимеризуются сначала

âдимеры, затем в ещ¸ растворимые, особенно в кислой среде, олигомеры, и в конечном итоге

âфибрин-полимер.

Âпроцессе образования гемостатического тромба распространения тромбообразования от места повреждения стенки сосуда по сосудистому руслу не происходит, так как этому препятствуют быстро возрастающий вслед за св¸ртыванием антикоагулянтный потенциал крови и активация фибринолитической системы.

Рисунок 1

Схема свертывания крови (www.bsmu-all.narod.ru/mats/biochem)

19

АНТИКОАГУЛЯНТЫ

Сохранение крови в жидком состоянии и регуляция скоростей взаимодействия факторов во все фазы коагуляции во многом определяются наличием в кровотоке естественных веществ, обладающих антикоагулянтной активностью. Жидкое состояние крови обеспечивает равновесие между факторами, активирующими св¸ртывание крови, и факторами, препятствующими его развитию, прич¸м последние не выделяются в отдельную функциональную систему, так как реализация их эффектов чаще всего невозможна без участия прокоагулянтных факторов. Вещества, обладающие антикоагулянтной активностью, постоянно синтезируются в организме и с определ¸нной скоростью выделяются в кровоток. К ним относятся антитромбин III, гепарин, протеины С и S, недавно открытый ингибитор тканевого пути св¸ртывания — TFPI (ингибитор комплекса ТФ-ф. VIIa-Ca2+), бета-2-макроглобулин, антитрипсин и др. Это так называемые первичные (физиологические) антикоагулянты.

В процессе свертывания крови и фибринолиза из факторов св¸ртывания и других белков также образуются вещества, обладающие антикоагулянтной активностью: антитромбин – I, продукты распада протромбина (дериваты протромбина), фибринопептиды, продукты деградации фибрина (ПДФ). Это так называемые вторичные (патологические) антикоагулянты. Антикоагулянты оказывают выраженное действие на все фазы св¸ртывания крови, поэтому исследование их активности при нарушениях св¸ртывания крови очень важно.

Антитромбин III

Одним из важнейших белков противосвертывающей системы является антитромбин III, который вместе с протеином С и некоторыми другими ингибиторами является главным регулятором гемостатического механизма. Антитромбин III - это белок с молекулярной массой 60 000, который относится к группе сериновых протеиназных ингибиторов, синтезируемых в печени, и связывающихся с инактивируемыми сериновыми протеазами через каскад св¸ртывания.

Хотя название «антитромбин» обусловлено взаимодействием с тромбином, антитромбин III также инактивирует факторы ХIIа, ХIа, Ха и IХа пут¸м связывания с сериновыми остатками активных центров этих протеаз.

Кинетика взаимодействия может быть ускорена во много раз добавлением гепарина. Гепарин связывается с центрами антитромбина III и действует как аллостерический регулятор. После образования комплекса протеазы с антитромбином III гепарин высвобождается и может связываться с другими молекулами антитромбина III. Такое «каталитическое» ускорение активности антитромбина III гепарином названо гепарин-кофакторной активностью, которая требуется для полного антикоагулянтного действия гепарина в плазме.

Âходе нормального гемостаза антитромбин III активируется пут¸м связывания с гепариноподобными гликозаминогликанами (гепаранами), находящимися на поверхности эндотелиальных клеток.

Антитромбин III - ингибитор всех сериновых протеаз, вовлеченных в процесс свертывания крови. Физиологическое значение антитромбина III подтверждает выраженная тенденция к тромбоэмболиям при врожденном дефиците его.

Выделены 3 типа врожденного дефицита антитромбина III:

1. снижение концентрации и функциональной активности,

2. снижение только функциональной активности при нормальном содержании ингибитора, 3. снижение только гепарин-кофакторной активности при нормальной активности и концентрации.

Причинами приобретенного дефицита антитромбина III являются:

- снижение синтеза, - пассивная потеря с биологическими жидкостями при кровопотере и повышенной сосудистой

проницаемости, - снижение за счет потребления при активации свертывающей системы,

- уменьшение синтеза антитромбина III при заболеваниях печени (цирроз), - нефротический синдром в результате экскреции ингибитора с мочой, - применение оральных контрацептивов и введение гепарина.

При всех формах дефицита антитромбина III возникает ДВС - синдром. Лечение и предупреждение дефицита антитромбина III возможно введением свежезамороженной плазмы. Однако при этом пациенту следует ввести не менее 1,0 л свежезамороженной плазмы, что не всегда показано из-за риска возникновения недостаточности почек, сердца, отека легких. В этом случае лиофильно высушенный концентрат антитромбина III является препаратом выбора. Таким образом, диагностические наборы для определения активности антитромбина III в плазме крови и в концентратах лечебного препарата - антитромбина III являются чрезвычайно актуальными.

Âнастоящее время расшифрована первичная структура многих ферментов, что позволило искусственно синтезировать пептиды с аминокислотной последовательностью, аналогичной участкам субстратов, расщепляемых тромбином, плазмином и другими ферментами свертывающей системы

20