6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторные_методы_исследования_системы_гемостаза_и_диагностика

Проведение анализа на агрегометре

Исследование на агрегометре провести в соответствии с инструкцией к прибору (Биола, Chrono-Log, Solar). Следует учитывать, что принцип работы этих приборов различен, получаемые агрегатограммы имеют различный вид, число определяемых параметров агрегации не одинаково.

Нормальные значения для агрегометра Биола:

АДФ – 50-75% Ристоцетин – 55-95% Коллаген – 50-80%

Нормальные значения для агрегометра Chrono-Log:

АДФ – 55-75% Ристоцетин – 55-85% Коллаген – 50-70%

Концентрации агонистов подобраны таким образом, что позволяют без дополнительного разведения верифицировать 97% всех наследственных и приобретенных тромбоцитопатий.

В то же время для контроля за препаратами, обладающими антиагрегатным действием, для получения значительно разбавленных растворов АДФ следует использовать следующие процедуры разведения исходного раствора.

Приготовление растворов АДФ

Запись агрегатограммы

Провести запись агрегатограммы (ОТП от 15-20 доноров) под влиянием всех 3 индукторов агрегации, установить пороговые дозы агрегации для получения однофазной обратимой и двухфазной необратимой агрегации.

Провести запись агрегатограммы исследуемой плазмы пациента. Сравнить полученные результаты с данными контрольных анализов.

По агрегатограмме определить степень агрегации (максимальное светопропускание, %), скорость агрегации (% светопропускания/мин), время агрегации (мин).

АДФ-агрегация проводится для исследования первой фазы (фаза обратимой агрегации и частичной секреции) и второй фазы (фаза необратимой агрегации и полной дегрануляции). При низких концентрациях после первой волны агрегации наступает дезагрегация и снижение агрегатограммы. При более высоких концентрациях АДФ (2,5-5·10-6 М) наблюдается двухволновая агрегатограмма. Для появления второй волны требуется синтез тромбоксана А2, и на этот процесс влияют ингибиторы циклооксигеназы (аспирин), однако вторая волна агрегации на АДФ зачастую сливается с первой волной и не видна отчетливо на агрегатограмме.

Агрегатограмма на коллаген имеет лаг-фазу, при которой происходит полимеризация коллагена, и имеет одну волну агрегации. Агрегация с коллагеном обусловлена высвобождением из тромбоцитов адениновых нуклеотидов и проводится для оценки секреторной функции клеток.

Ристоцетиновая агрегация возможна при нормальных тромбоцитах и нормальном содержании ф. Виллебранда. При болезни Виллебранда имеется дефект ф. Виллебранда, являющегося частью комплекса с фактором VIII, и агрегация нарушена. Агрегация на ристоцетин нарушена также при синдроме Бернара-Сулье. Внесение в исследуемую ОТП БТП от донора нормализует агрегатограмму при болезни Виллебранда и не нормализует при синдроме Бернара-Сулье.

41

Набор реагентов для определения активности ф. Виллебранда на агрегометре фирмы Биола

Состав набора: 1.Фиксированные человеческие тромбоциты, 2. Ристомицин, 3. Плазмакалибратор, 4. Буфер концентрат.

Принцип метода: метод определения активности ф. Виллебранда основан на его способности вызывать агглютинацию тромбоцитов в присутствии антибиотика ристоцетина (ристомицина). Способность к такой агглютинации сохраняется у тромбоцитов после их фиксации формальдегидом, когда полностью утрачивается реакция на другие индукторы агрегации.

Виллебранд-реагент

Состав набора: лиофильно высушенная смесь ристомицина и фиксированных тромбоцитов.

НАБОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЧТВ

Тест АЧТВ является одним из самых информативных основных тестов, который отражает изменение активности факторов контактного пути активации свертывания крови (внутреннего пути). Тест чувствителен к дефициту всех факторов свертывания крови (кроме ф. VII), к гепарину, к специфическим и неспецифическим ингибиторам.

Тест используют для выявления широкого спектра коагуляционных нарушений:

-для исследования причины кровотечения или тромбозов;

-для выявления волчаночного антикоагулянта;

-для диагностики гемофилии;

-при исследовании причин патологии беремености;

-для мониторинга антикоагулянтной терапии, в том числе гепаринотерапии;

-для выявления диссеминированного внутрисосоудистого свертывания;

-для обнаружения дефицита отдельных факторов свертывания крови;

-для обнаружения специфических ингибиторов свертывания (например, к ф. VIII);

-для выявления неспецифических ингибиторов свертывания (волчаночный антикоагулянт);

-перед хирургическим вмешательством для исследования возможности кровоточивости;

-для выявления заболеваний печени.

Удлинение теста АЧТВ может быть вызвано:

-синдромом диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС);

-заболеванием печени, где синтезируются почти все факторы свертывания крови;

-массивными гемотрансфузиями цитратной крови;

-введением гепарина;

-дефицитом факторов внутреннего пути свертывания;

-дефицитом витамина К;

-присутствием ингибиторов свертывания, как специфических, так и неспецифических;

-наличием волчаночного антикоагулянта;

-наличием гемофилии.

Укорочение теста АЧТВ свидетельствует о гиперкоагуляции и опасности возникновения тромбозов.

Тест не улавливает нарушения в тромбоцитах, недостаточность проконвертина (ф.VII), фибринстабилизирующего ф. (ф.XIII) и недостаток кальция в системе.

Набор реагентов для выполнения коагуляционных тестов (Коагуло-тест)

Для определения АЧТВ, ЧТВ и АВР.

Состав набора: лиофильно высушенный фосфолипидный реагент эрилид (аналог импортного кефалина), легкая фракция каолина, 0,025 М раствор кальция хлористого;

Принцип метода:

-АЧТВ. Инкубирование плазмы с оптимальным стандартизованным соотношением фосфолипидов

èкаолина активирует факторы внутреннего пути свертывания. Добавление в систему ионов кальция купирует цитрат плазмы и позволяет получить фибриновый сгусток. В процессе измерения АЧТВ регистрируют время от момента добавления ионов кальция до момента образования сгустка.

-ЧТВ. Добавление к исследуемой плазме веществ, обладающих способностью к контактной активации ф. Хагемана, таких, как суспензия каолина, стандартизирует начальную фазу процесса свертывания крови и значительно ускоряет этот процесс. При этом дальнейшая активация факторов коагуляционного каскада происходит на собственных (присутствующих в исследуемой плазме) фосфолипидных матрицах.

42

- АВР. Принцип основан на определении времени свертывания плазмы при добавлении к ней оптимального количества фосфолипидов и кальция хлорида.

В норме АЧТВ составляет 35-45 секунд, ЧТВ - 55-75 секунд, АВР – 70-90 секунд.

Кефалин-каолиновая смесь чувствительна к присутствию волчаночного антикоагулянта (в этом случае АЧТВ удлиняется).

Набор реагентов для определения активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) (Коагуло-экспресс)

Состав набора: лиофильно высушенная смесь каолина и эрилида, 0,025 М раствор кальция хлористого;

Принцип метода: инкубирование плазмы с оптимальным стандартизованным соотношением фосфолипидов и каолина активирует факторы внутреннего пути свертывания. Добавление в систему ионов кальция купирует цитрат плазмы и позволяет получить фибриновый сгусток. В процессе измерения АЧТВ регистрируют время от момента добавления ионов кальция до момента образования сгустка.

В норме АЧТВ составляет 35-45 секунд.

Набор реагентов для определения активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ)

Состав набора: лиофильно высушенный АЧТВ-реагент, содержит эллаговую кислоту и фосфолипиды сои, 0,025 М раствор кальция хлористого.

Принцип метода: к исследуемой плазме добавляют реагент, представляющий собой водный раствор эллаговой кислоты (активатор внутреннего пути свертывания) в комплексе с соевыми фосфолипидами. В процессе измерения АЧТВ регистрируют время от момента добавления ионов кальция до момента образования сгустка.

В норме АЧТВ составляет 25-35 секунд.

НАБОРЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОТРОМБИНОВОГО ВРЕМЕНИ

Во внешнем пути свертывания ключевое место отводится тканевому тромбопластину. Внешний путь свертывания принято in vitro моделировать тестом протромбинового времени, когда к исследуемой цитратной плазме, бедной тромбоцитами, добавляют тромбопластин, представляющий собой солевой экстракт тканей, содержащий тканевой тромбопластин и фосфолипиды.

Протромбиновый тест был предложен в 1935 г. A.Quick с целью анализа в системе in vitro активности протромбина - ф.II свертывания крови.

Позднее было установлено, что этим тестом определяется активность нескольких факторов свертывания крови (факторов протромбинового комплекса): ф.II (протромбин), ф.VII (проконвертин), ф.X (Стюарта) и ф. V (проакселерин). Для проведения теста требуется тканевой тромбопластин, фосфолипиды и ионы кальция.

Тест на протромбин является одним из основных базовых тестов, используемых в повседневной клинической практике.

Тест используют:

·для выявления нарушений активности факторов внешнего пути свертывания,

·для оценки функции печени,

·для контроля за лечением антикоагулянтами непрямого действия.

Основным реагентом в тесте является тромбопластин - солевой экстракт тканей (легкие, плацента, головной мозг) животных и человека.

Принцип метода. Определяется время свертывания бедной тромбоцитами цитратной плазмы в присутствии ионов кальция и избытка тканевого тромбопластина. В этих условиях время образования сгустка фибрина зависит только от активности факторов протромбинового комплекса.

Удлинение протромбинового времени связано с:

-введением пероральных антикоагулянтов;

-заболеванием печени;

-дефицитом витамина К;

-ÄÂÑ;

-наследственным дефицитом протромбина, ф.VII, ф.X или ф.V. Укорочение протромбинового времени связано с опасностью тромбозов.

43

Способы выражения результатов протромбинового теста:

1.ПВ – время свертывания плазмы при добавлении тромбопластина (норма 14-18 ñåê);

2.ПО=ПВ плазмы больного/ПВ нормальной плазмы (норма 0,9-1,1);

3.ÌÍÎ=ÏÎÌÈ× (норма 0,8-1,2);

4.активность протромбина по Квику (рассчитывается по калибровочному графику, норма 70130%);

5.ПИ=(ПВ нормальной плазмы/ПВ плазмы больного) х 100 (норма 80-120%).

Расчет MHO позволяет клиницисту использовать в работе таблицы соответствия MHO и необходимого и достаточного уровня антикоагулянтной терапии (таблица 9).

Таблица 9.

Рекомендуемые границы МНО

Компания РЕНАМ выпускает 2 типа лиофильно высушенных тромбопластинов, аттестованных по МИЧ, полученных из головного мозга кроликов:

1.тромбопластины, не содержащие кальция хлористого;

2.тромбопластины в смеси с кальцием хлористым.

Кроме реагентов для исследования в венозной плазме, разработан набор реагентов для определения протромбинового времени в капиллярной крови.

Набор реагентов для определения протромбинового времени (Диагем-П)

Тромбопластин – лиофильно высушенный водорастворимый реагент, полученный из мозга кроликов, предназначен для определения протромбинового времени в плазме венозной крови. Результаты определения могут быть выражены в значениях МНО, протромбинового отношения, протромбина по Квику и протромбинового индекса.

Состав набора: 1. Тромбопластин; 2. 0,025М раствор кальция хлористого.

Принцип метода: при добавлении к исследуемой цитратной плазме избытка тканевого тромбопластина и ионов кальция время образования сгустка фибрина зависит только от активности факторов внешнего и общего пути коагуляции: I, II, V, VII, X.

Измеряют время образования фибринового сгустка после внесения в исследуемую плазму тромбопластина и кальция хлористого.

Тест можно проводить ручным методом или с использованием электромеханических или фотооптических коагулометров.

Тромбопластин (из головного мозга кролика) для определения протромбинового времени (Ренампластин)

Ренампластин является усовершенствованным реагентом, в котором содержится и тромбопластин, и кальций, что упрощает метод анализа протромбинового времени.

Ренампластин – тромбопластин-кальциевый реагент, водорастворимый, полученный из мозга кроликов и аттестованный по МИЧ, предназначен для определения протромбинового времени в плазме венозной крови. Результаты определения могут быть выражены в значениях МНО, протромбина по Квику, и протромбинового индекса.

Тест можно проводить ручным методом или с использованием электромеханических или фотооптических коагулометров.

Принцип метода: при добавлении к исследуемой цитратной плазме избытка тканевого тромбопластина и ионов кальция время образования сгустка фибрина зависит только от активности факторов внешнего и общего пути коагуляции: I, II, V, VII, X.

44

Измеряют время от момента добавления к исследуемой плазме тромбопластина с кальцием до момента образования фибринового сгустка.

Стабильность раствора Ренампластина:

Протромбин по Квику, %.

Для построения калибровочного графика: готовят ряд разведений контрольной плазмы 0,9% раствором натрия хлористого по следующей схеме:

*А – аттестованное значение протромбина по Квику, %, в контрольной плазме, указано в паспорте.

Для каждого разведения контрольной плазмы определяют протромбиновое время (ПВ) в сек. Строят калибровочный график зависимости продолжительности ПВ, сек, от соответствующей активности протромбина, %. Затем определяют ПВ в исследуемых образцах и по графику рассчитывают протромбин по Квику.

Образцы с высоким уровнем протромбина по Квику могут выйти за пределы линейности, что приводит к искажению результатов. Поэтому точные значения активности протромбина по Квику для таких образцов могут быть получены при разведении исследуемой плазмы физиологическим раствором в 2 раза. При этом результат, считанный из калибровочного графика, должен быть умножен на 2.

Чувствительность Ренампластина к гепарину: Ренампластин не чувствителен к гепарину в дозе до 1 МЕ/мл, что позволяет использовать данный реагент при гепаринотерапии.

Набор реагентов для определения протромбинового времени, протромбинового отношения, протромбинового индекса, протромбина по Квику и МНО в КАПИЛЛЯРНОЙ КРОВИ

(Диакап-П)

Капиллярная кровь. Определение протромбинового времени удобно проводить в капиллярной крови, получаемой при проколе пальца. Однако в крови содержатся форменные элементы крови, которые влияют на процесс свертывания. Учитывая это, в набор реагентов Диакап-П, кроме Ренампластина, включен специальный консервант крови в виде концентрированного раствора.

НАБОРЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ТРОМБИНОВОГО ВРЕМЕНИ

Определение тромбинового времени характеризует конечный этап процесса свертывания - превращение фибриногена в фибрин под действием тромбина, на него влияет концентрация фибриногена в плазме и наличие продуктов деградации фибрина.

Для дифференциальной диагностики проводят количественное определение фибриногена, продуктов деградации фибрина и др., позволяющие уточнить диагноз. Образование сгустка не происходит в терминальной стадии ДВС-синдрома, а также при внутривенном введении большой дозы гепарина.

Ключевым реагентом при проведении теста является реагент тромбин, который должен:

1.быть выделен в максимально очищенном виде,

2.сохранять свою активность при выделении и лиофилизации.

При проведении теста используют тромбин с активностью 3 МЕ/мл и 6 МЕ/мл. Для исследования плазмы, не содержащей гепарин, как правило, используют тромбин с активностью 3 МЕ/мл. При работе с гепаринизированной плазмой необходимо использовать тромбин с активностью 6 МЕ/ мл.

45

Следует отметить, что при использовании тромбина с активностью 3 МЕ/мл время свертывания должно лежать в диапазоне 16-21 (±5) сек, а при использовании тромбина с активностью 6 МЕ/ мл время свертывания должно находится в более узком диапазоне 9-13 (±2) сек.

Таким образом, принято в первом случае считать патологией отклонение от нормы более чем на 5 сек, во втором случае - на 2 сек.

Набор реагентов для определения тромбинового времени (Тромбин-тест)

Состав набора: стабилизатор (этиленгликоль), тромбин человека, лиофильно высушенный. Принцип метода определения заключается в том, что при добавлении тромбина к исследуемой цитратной плазме время образования сгустка фибрина зависит только от количества и активности фибриногена в данной плазме, от активности тромбина и от наличия ингибиторов. Реакция

проходит в одну стадию.

Для анализов удобно готовить 2 раствора тромбина: стабилизированный раствор тромбина, который допускается хранить в течение месяца при температуре 2-8°С и рабочий раствор тромбина, который используется в течение 2 ч в день изготовления.

Набор реагентов для определения тромбинового времени (Тромбин-реагент)

Набор реагентов предназначен для определения тромбинового времени – скринингового интегрального теста для мониторинга гепаринотерапии, антикоагулянтной и фибринолитической терапии, а также для выявления:

-диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС);

-продуктов деградации фибриногена/фибрина;

-наследственной или приобретенной количественной и качественной недостаточности фибриногена.

Состав набора:

-тромбин-реагент, лиофильно высушенный – 9 флаконов;

-растворитель для тромбин-реагента, концентрат (6,0 мл) – 1 флакон.

Принцип метода

Определяется продолжительность времени образования фибринового сгустка (тромбиновое время) после добавления к плазме крови раствора тромбина.

Один набор предназначен для проведения от 200 до 600 анализов.

Стандартизация Тромбина: каждая серия Тромбина для определения тромбинового времени аттестована по активности в МЕ/мл против вторичного Международного стандарта по процедуре, утвержденной Европейской Фармакопеей.

Пределы времени свертывания в контрольной плазме с активностью тромбина 3 и 6 IU/мл указаны в паспорте на набор.

Чувствительность Тромбина к гепарину: рабочие растворы тромбина с активностью 3 и 6 МЕ/мл чувствительны к присутствию гепарина в исследуемой плазме, что позволяет проводить данными реагентами мониторинг за введением гепарина.

Стабильность растворов тромбина

*не рекомендуется повторное замораживание реагента.

46

Удлинение тромбинового времени может быть вызвано:

-молекулярными аномалиями и снижением уровня фибриногена (менее 1,0 г/л),

-избытком в крови гепарина в результате гепаринотерапии,

-проведением фибринолитической терапии,

-накоплением продуктов деградации фибрина/фибриногена,

-парапротеинемией,

-наследственной и приобретенной дисфибриногенемией,

-наличием в плазме ингибиторов тромбина и фибриногена.

-гипофибриногенемии, связанной с ДВС или наследственной или приобретенной патологией;

-повышенной концентрации продуктов деградации фибриногена/фибрина;

-присутствии в крови гепарина;

-наличии в крови ингибиторов тромбина или фибриногена;

-дисфибриногенемии, связанной с заболеванием печени или при наследственной патологии. Укорочение тромбинового времени свидетельствует о риске тромбозов.

Нормальные значения тромбинового времени:

-тромбин с активностью 6 МЕ/мл - 9-12 ñåê,

-тромбин с активностью 3 МЕ/мл - 14-18 ñåê.

НАБОРЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ФИБРИНОГЕНА

Количественный анализ фибриногена по методу Клаусса проводится при гиперфибриногенемиях, связанных с тяжестью воспалительных, иммунных, деструктивных процессов, с риском развития гипервискозного синдрома, артериальных тромбозов и инфарктов органов. Снижение концентрации фибриногена наблюдается при остром ДВС-синдроме, при лечении фибринолитиками, при врожденных гипо- и дисфибриногенемиях.

Принцип метода основан на особенностях кинетики реакции фибриноген-тромбин, когда исследуемую плазму крови разбавляют в 10 раз с целью снижения влияния ингибиторов тромбина (антитромбина III и др.). В этих условиях при высоких концентрациях тромбина и низких концентрациях фибриногена время образования сгустка зависит только от количества фибриногена.

Метод Клаусса очень прост в исполнении, определяет только активный фибриноген, метод точен и стандартен, широко применяется за рубежом.

Единственный недостаток метода - невозможность работы ручным методом, т.к. образуемый сгусток плохо различим визуально. Однако любые механические или оптико-механические коагулометры позволяют получить точные и воспроизводимые результаты исследования фибриногена по Клауссу. В плазме доноров содержание фибриногена колеблется от 1,8 до 3,5 г/л. Для работы на оптических коагулометрах в инкубационную смесь вносят специально разработанный мелкодисперсный каолин.

Набор реагентов для определения содержания фибриногена (Фибриноген-тест).

Для работы на механических анализаторах.

Состав набора: тромбин, лиофильно высушенный, концентрат имидазолового буфера, плазмакалибратор, лиофильно высушенная.

Набор реагентов для определения содержания фибриногена (ОптиФибриноген-тест).

Для работы на оптических анализаторах.

Состав набора: тромбин, содержащий легкую фракцию каолина, лиофильно высушенный, концентрат имидазолового буфера, плазма-калибратор, лиофильно высушенная.

Принцип метода: определение содержания фибриногена основано на измерении времени свертывания разведенной плазмы избытком тромбина. В этом случае время свертывания зависит только от концентрации фибриногена в плазме. Концентрацию фибриногена определяют по калибровочной прямой, используя плазму с известным содержанием фибриногена.

Чувствительность тромбина к гепарину: в состав тромбина входит инактиватор гепарина, что позволяет использовать данный реагент для измерения содержания фибриногена в гепаринизированных образцах плазмы больных.

Набор предназначен для всех типов коагулологических анализаторов, кроме тех, где используют суспензию каолина (необходимо обратить внимание на инструкцию, прилагаемую к

47

коагулологическому анализатору). Кроме того, в инструкции к анализатору следует обратить внимание на чувствительность прибора к данному тесту.

В норме содержание фибриногена в плазме крови колеблется от 1,8 до 4,0 г/л. Содержание фибриногена при различных заболеваниях приведено в таблице 10.

НАБОРЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ АНТИТРОМБИНА III

Определение активности антитромбина III, основного ингибитора тромбина, проводится с целью диагностики наследственного и приобретенного дефицита этого физиологического антикоагулянта, приводящего к развитию диссеминированного внутрисосудистого свертывания и острых тромбозов.

НПО «РЕНАМ» представляет 3 метода определения активности антитромбина III:

1.клоттинговый метод Абильдгаард в двух модификациях;

2.метод с хромогенным субстратом.

Плазмы-калибраторы, входящие в состав наборов компании «РЕНАМ», аттестуются по зарубежным стандартным плазмам производства ведущих мировых фирм (Dade-Behring).

Набор реагентов для определения активности антитромбина III в плазме крови человека по U. Abildgaard (Абильгаард-АТ III тест)

Состав набора: 1. Тромбин, лиофилизированный, 2. Плазма - калибратор, лиофилизированая,

3.Буфер имидазоловый концентрированный, 4. Стабилизатор (этиленгликоль).

Принцип метода: оценку активности антитромбина III в исследуемой плазме проводят по

остаточной активности тромбина после его взаимодействия с антитромбином III в дефибринированной плазме.

Определение активности антикоагулянта проводят по калибровочному графику, в котором время образования сгустка фибрина прямо пропорционально активности антитромбина III. Процесс стандартизуется проведением реакции при постоянной температуре (37°С).

Âтесте участвуют 3 плазмы: исследуемая (дефибринируется), плазма-калибратор с аттестованной активностью антитромбина III (дефибринируется) и фибриноген-плазма (в набор не входит, можно использовать любую плазму), являющаяся источником фибриногена.

Âисследуемой плазме крови тепловой обработкой удаляют фибриноген, вносят стандартное количество тромбина, содержащего инактиватор гепарина, смесь инкубируют и затем определяют

âней остаточную (после взаимодействия с антитромбином III) активность тромбина. Чем активнее антитромбин III в исследуемой плазме, тем меньше остаточная активность тромбина, и тем медленнее происходит образование сгустка.

Замечание лиофильно высушенный: образцы исследуемой плазмы с высоким уровнем активности АТ III могут полностью нейтрализовать тромбин в системе, что приводит к искажению результатов. Поэтому точные значения активности АТ III для таких образцов могут быть получены при разведении исходной плазмы в 2 раза. При этом полученный результат необходимо умножить на 2. Возможное присутствие в исследуемой плазме гепарина до 1 ед/мл не влияет

48

на измерение активности антитромбина III за счет присутствия в тромбине инактиватора гепарина.

Набор реагентов для определения активности антитромбина III в плазме крови человека по U. Abildgaard (Реаклот-АТ III)

Состав набора: 1. Тромбин, лиофильно высушенный, 2. Фибриноген, лиофильно высушенный, 3. Дефибринированная плазма - калибратор, лиофильно высушенная, 4. Буфер имидазоловый концентрированный.

Принцип метода: в исследуемой плазме тепловой обработкой удаляют фибриноген, вносят стандартное количество тромбина, смесь инкубируют и затем определяют в ней остаточную (после взаимодействия с антитромбином III) активность тромбина. Активность тромбина определяют по времени свертывания стандартного раствора фибриногена. Чем выше активность антитромбина III в исследуемой плазме, тем ниже остаточная активность тромбина, и тем медленнее происходит образование сгустка. В состав набора включен усовершенствованный реагент тромбина, не требующий стабилизатора, а также специально приготовленный реагент фибриногена.

Замечание: образцы исследуемой плазмы с высоким уровнем активности АТ III могут полностью нейтрализовать тромбин в системе, что приводит к искажению результатов. Поэтому точные значения активности АТ III для таких образцов могут быть получены при разведении исходной плазмы в 6 раз. При этом полученный результат должен быть умножен на 2. Возможное присутствие в исследуемой плазме гепарина до 1 ед/мл не влияет на измерение активности антитромбина III, за счет присутствия в тромбине инактиватора гепарина.

Набор реагентов для определения активности антитромбина III

оптическим методом (Реахром-АТ III)

Состав набора: 1. Буфер с гепарином концентрированный, 2. Тромбин человека, 3. Плазмакалибратор, лиофильно высушенная, 4. Хромогенный субстрат, лиофильно высушенный.

Принцип метода основан на способности АТ III нейтрализовать тромбин в присутствии гепарина. Активность АТ III определяют в плазме, добавляя к ней избыток тромбина. При этом происходит ингибирование тромбина комплексом АТ III-гепарин пропорционально количеству АТ III в плазме. Оставшееся количество тромбина катализирует отщепление паранитроанилина (рNА) от синтетического хромогенного субстрата. Абсорбция свободного pNA, определяемая при 405 нм, обратно пропорциональна активности АТ III.

Процесс идет по следующей схеме:

АТ III + гепарин (избыток) = АТ III-гепарин;

АТ III-гепарин + тромбин (избыток) = АТ III-гепарин-тромбин + тромбин (остаток); Субстрат-рNA + тромбин (остаток) = Пептид + рNA.

Замечание: Образцы исследуемой плазмы с высоким уровнем активности АТ III могут полностью нейтрализовать тромбин в системе, что приводит к искажению результатов. Поэтому точные значения активности АТ III для таких образцов могут быть получены при разведении исходной плазмы в 40 раз. При этом полученный результат необходимо умножить на 2.

Заниженные результаты могут быть получены при анализе образцов плазм больных:

-с повышенным содержанием липидов;

-с повышенным содержанием билирубина.

Интерпретация результатов:

У здоровых лиц активность антитромбина III варьирует от 80 до 125 %, при снижении

активности до 40-60% наблюдаются спонтанные тромбозы и эмболии.

В большинстве случаев снижение плазменного уровня антитромбина III носит приобретенный характер из-за уменьшения биосинтеза, пассивной потери с биологическими жидкостями и в результате потребления на инактивацию сериновых протеаз при активации свертывающей системы крови. Уменьшение биосинтеза антитромбина III происходит при заболеваниях печени. Увеличение пассивной потери наблюдается при нефротических протеинуриях и энтеропатиях. При всех формах дефицита антитромбина III возникает ДВС-синдром.

НАБОРЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОТЕИНА С

Исследование активности протеина С проводится с целью диагностики врожденной и приобретенной недостаточности этого физиологического антикоагулянта, приводящей к инфарктам, тромбоэмболии легочной артерии и тромбозам различной локализации.

НПО «РЕГНАМ» выпускает 3 диагностических набора реагентов, предназначенных для определения общей активности системы протеина С:

49

1.для определения общей активности протеина С,

2.для определения активности протеина С фотометрическим методом с хромогенным субстратом,

3.для выявления мутантного ф. V Лейден, резистентного к действию протеина С. Компания РЕНАМ выпускает также 2 контрольные плазмы с нормальным и с пониженным

уровнем протеина С.

Набор реагентов для скрининговой оценки нарушений в системе протеина С (Протеин С-скрининг тест)

Состав набора: 1. АЧТВ-реагент; 2. АЧТВ-реагент с активатором протеина C; 3. Плазмакалибратор; 4. 0,025 М раствор кальция хлорида.

Принцип метода: инкубация исследуемой плазмы с активатором вызывает активацию эндогенного протеина С и протеина S, что удлиняет время свертывания нормальной плазмы в тесте АЧТВ. Без добавления активатора АЧТВ в этой же плазме не изменено. В плазме с дефицитом активности системы протеина С или при наличии мутантного ф. V (Лейден) это удлинение менее выражено, чем в норме.

Результаты определения активности системы протеина С принято выражать в виде Нормализованного Отношения (НО):

(АЧТВактив/АЧТВ) больн,

(АЧТВактив/АЧТВ) калибр

где: НО калибр – Нормализованное Отношение плазмы-калибратора, указано в паспорте на набор.

Интерпретация результатов: у здоровых лиц НО составляет 1,0 ± 0,3. Значение НО ниже 0,7 свидетельствует о значительных нарушениях в системе протеина С (функциональная неполноценность, сниженный синтез протеина С, протеина S) или о наличии мутантного ф. V (Лейден), резистентного к действию протеина С. Образцы плазмы пациентов с повышенным содержанием гепарина должны быть исключены из исследования. Прием антикоагулянтов непрямого действия и наличие у пациентов волчаночного антикоагулянта могут приводить к ложноположительным результатам определения активности системы протеина С.

Набор реагентов для определения активности протеина С оптическим методом (Реахром-Протеин С)

Набор реагентов Реахром-Протеин С предназначен для определения активности протеина С оптическим методом с хромогенным субстратом с целью диагностики врожденной и приобретенной недостаточности этого физиологического антикоагулянта, приводящей к инфарктам, тромбоэмболии легочной артерии и тромбозам различной локализации.

Состав набора: 1. Буфер концентрированный. 2. Активатор Протеина С лиофильно высушенный.

3.Плазма-калибратор лиофильно высушенная. 4. Хромогенный субстрат лиофильно высушенный. Принцип метода: метод определения активности протеина С в образце плазмы основан на

способности активированного протеина С гидролизовать пептидный хромогенный субстрат. Количество высвобождаемого при этом паранитроанилина (рNА) прямо пропорционально активности протеина С в образце плазмы. Протеин С плазмы активируется при добавлении к ней очищенного активатора протеина С.

Замечание: Образцы с высоким уровнем активности протеина С могут выйти за пределы линейности, что приводит к искажению результатов. Поэтому точные значения активности протеина С для таких образцов могут быть получены при разведении исходной плазмы в 2 раза. При этом результат, считанный из калибровочного графика, должен быть умножен на 2.

Завышенные результаты могут быть получены при анализе образцов плазм больных:

·с повышенным содержанием липидов;

·с повышенным содержанием билирубина.

Набор реагентов для определения резистентности активированного ф. V к действию активированного протеина С (РеаPrC/FV тест)

Состав набора: 1. АЧТВ - реагент лиофильновысушенный; 2. АЧТВ-реагент с активатором протеина С лиофильно высушенный; 3. Плазма-калибратор лиофильно высушенная; 4. Плазма субстратдефицитная по фактору V; 5. 0,025 М раствор кальция хлорида.

50