6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторные_методы_исследования_системы_гемостаза_и_диагностика

Таблица 3

Алгоритм диагностики нарушений гемостатических функций.

(Т.В. Вавилова, А.Б.Добровольский, 2007)

Лаборатории первичного звена

Оценочные тесты 1-го уровня

Количество тромбоцитов, время кровотечения, АЧТВ (АПТВ), протромбиновый тест, фибриноген по Клауссу, время свертывания крови.

Лаборатории диагностических центров и стационаров

Оценочные тесты 2-го уровня

Агрегация тромбоцитов, тромбиновое время, Д-димер (или РФМК), лизис эуглобулиновых фракций (Хагеман-зависимый фибринолиз)

Специализированные лаборатории

Дополнительные тесты

Контроль антитромботической терапии

Нефракционированный гепарин — АЧТВ. Антагонисты витамина К — MHO.

Считаем целесообразным привести лабораторные диагностические комплексы, предлагаемые Т.В. Вавиловой (2005 г). Они более подробны и составлены с учетом общих принципов лабораторной диагностики — исследования от «простого к сложному», с учетом специфичности и чувствительности методов.

Экспресс исследования в условиях оказания экстренной помощи:

количество тромбоцитов, время кровотечения, АЧТВ, протромбиновое время (активность или индекс), фибриноген, Д-димеры.

Коагулограмма скрининговая — выполняется в случае предполагаемых приобретенных нарушений свертывающей системы, в основном в коагуляционном гемостазе, при заболеваниях печения, почек, в акушерской практике без подозрения на развитие острого синдрома ДВС: количество тромбоцитов, АЧТВ, протромбиновое время (активность или индекс), тромбиновое время, фибриноген, растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК),

Коагулограмма развернутая — выполняется при наблюдении за больным с выраженными расстройствами системы гемостаза, при предполагаемом развитии синдрома ДВС после массивных кровопотерь и гемотрансфузий, при всех видах шока, у гематологических больных: количество тромбоцитов, АЧТВ, протромбиновое время, тромбиновое время, фибриноген, антитромбин III, РФМК, Д-димер, мазок периферической крови.

Скрининговые тесты при кровоточивости — выполняются при первичной постановке диагноза у больного с геморрагическим синдромом неясного генеза, в основном для диагностики врожденных коагулопатий: количество тромбоцитов, мазок периферической крови, время кровотечения, АЧТВ, протромбиновое время (активность или индекс), антитромбин III, фибриноген, РФМК, Д-димер.

Дополнительные тесты при кровоточивости — выполняются для окончательной постановки диагноза при геморрагическом синдроме. Выбор исследования зависит от результатов скрининговых тестов, анамнестических данных и клинической картины болезни: рептилазное время, фактор

31

Виллебранда — активность, антиген, функциональная индуцированная активность тромбоцитов, активность факторов (VIII, IX).

Скрининговые тесты при повышенном тромбообразовании — выполняются при венозном тромбозе любой локализации: количество тромбоцитов, АЧТВ, протромбиновое время (активность или индекс), фибриноген, РФМК, Д-димер, скрининговый тест на волчаночный антикоагулянт.

Дополнительные тесты при повышенном тромбообразовании — выполняются при повторных тромбозах или семейных тромбозах, тромбоэмболиях, возникающих в молодом возрасте, клиническом подозрении на тромбофилию. Выбор исследования зависит от клинической картины и локализации тромбообразования: морфофункциональная оценка активации тромбоцитов, антитромбин III, протеин С, волчаночный антикоагулянт (коррекционный и подтверждающий тест), аФЛ-антитела, аРС-резистентность, гомоцистеин, молекулярно-генетическое исследование.

Контроль антитромботической терапии

Дезагрегантная терапия — морфофункциональная оценка активации тромбоцитов. При приеме аспирина возможно определение 11-гидрокситромбоксана В2 в моче.

Антикоагулянты непрямого действия — MHO, периодически АЧТВ.

Нефракционированный гепарин — АЧТВ, тромбоциты, общий анализ мочи. Низкомолекулярный гепарин — тромбоциты, общий анализ мочи, маркеры тромбинемии

(Д-димер, РФМК).

Тромболитики — скрининговые тесты, рептилазное время, Д-димер.

Подготовка к оперативным вмешательствам

Операции на ЛОР-органах, в офтальмологии, челюстно-лицевой хирургии: количество тромбоцитов, время кровотечения, протромбиновое время (по показаниям, при общем обезболивании).

Общехирургические операции и операции без значительной кровопотери: количество тромбоцитов, АЧТВ, протромбиновое время, фибриноген.

Кардиохирургические операции, травматичные операции на органах брюшной полости, легких и операции с предполагаемой значительной кровопотерей: коагулограмма скрининговая.

ПОДГОТОВКА БОЛЬНОГО И ПРАВИЛА ВЗЯТИЯ МАТЕРИАЛА ДЛЯ АНАЛИЗА

Обеспечение качества исследования на преаналитическом этапе

Венозная кровь является основным материалом для исследования состояния гемостаза. При этом правильное взятие крови является чрезвычайно важным для результатов анализа.

Учитывая суточные биоритмы, кровь для исследования рекомендуется брать утром от 7 до 9 часов. С другой стороны, работа в лаборатории должна быть организована таким образом, чтобы свести до минимума время хранения проб, чтобы исследование начиналось как можно скорее.

Желательно брать кровь натощак у пациентов, отдохнувших не менее 15 мин после даже незначительной физической нагрузки. Больные должны быть предупреждены, что за 3 дня до исследования следует исключить тяжелые физические нагрузки и период воздержания от принятия алкоголя должен быть не менее 24 часов.

Важным моментом является сама техника взятия крови. Следует максимально ограничить влияние наложения жгута (лучше манжеты тонометра). Длительность венозного стаза не должна превышать 1 мин, а желательная сила сжатия на 10 мм Hg ниже диастолического давления крови. Стаз крови при длительном наложении манжеты вызывает активацию фибринолиза, повышение концентрации факторов гемостаза из-за освобождения белков из сосудистой стенки и активацию тромбоцитов. После 3 мин стаза крови происходит укорочение ПВ, АЧТВ и тромбинового времени, примерно на 10% повышается количество антитромбина, фибриногена и других факторов свертывания, ф.VIII в отдельных случаях повышается более чем на 20%.

Кровь берут из локтевой вены силиконированной иглой с широким просветом (внутренний диаметр 1,0 - 0,8 - 0,6 мм) без шприца (самотеком). Использование шприца нежелательно. Если кровь брать шприцем, он должен быть силиконированным или полиэтиленовым. Если кровь берется шприцем слишком быстро, то из-за турбулентного движения крови в шприце и смешивания ее с воздухом (вспенивание) происходит активация тромбоцитов и факторов свер-тывания крови. Если кровь брать медленно, то в шприце может начаться необратимое свертывание, опять же с активацией факторов гемостаза и последующим их потреблением.

32

После взятия кровь необходимо аккуратно в минимальные сроки перенести в пластиковую или стеклянную силиконированную пробирку с раствором цитрата натрия.

В современной лабораторной практике все чаще используются системы вакуумного взятия крови (вакутейнеры и вакуэты). Активация гемостаза в них предотвращается за счет быстрого смешивания поступающей крови с раство-ром цитрата натрия.

При прокалывании иглой сосуда тканевый тромбопластин попадает с током крови в пробирку, поэтому первые капли крови не годятся для проведения коагулологических тестов. Кровь для исследования системы гемостаза желательно брать во вторую пробирку. Кровь из первой пробирки рекомендуется использовать для подсчета форменных элементов. Так, например, АЧТВ, определяемое в первой пробирке, может быть на 20% короче, чем во второй.

Кровь рекомендуется брать:

-«бабочкообразной» иглой в градуированную силиконированную стеклянную или пластиковую пробирку, содержащую антикоагулянт;

-в градуированный пластиковый шприц, содержащий антикоагулянт;

-в моноветт - коммерческая аспирационная система (градуированный шприц), содержащая антикоагулянт;

-в вакутейнер - коммерческая система (пробирка с определенным отрицательным давлением для взятия точного объема крови), содержащая антикоагулянт (кровь берется в BD Vacutainer

ñ“голубой” крышкой – цветовым кодом);

-в специальные пробирки для транспортировки крови для исследования гемостаза. Например, пробирка СТАД содержит цитрат натрия (0,105 М), теофиллин, аденозин и дипиридамол. Три последних вещества предотвращают активацию тромбоцитов. СТАД существуют и в виде вакутейнеров. Скрининговые тесты и исследования отдельных факторов свертывания могут выполняться из СТАД так же, как из цитратной плазмы.

В некоторых клинических ситуациях (например, при шоке) взятие крови из локтевой вены затруднительно из-за низкого давления. Попытки набирать кровь с помощью шприца часто заканчиваются неудачей: кровь сворачивается. В неотложных ситуациях, когда невозможно взятие крови из периферической вены, можно использовать кровь, полученную из центрального (подклю-чичного) катетера. При этом желательно удалить до 10 мл крови (использовать ее на проведение гематологических или биохимических исследований), а затем забрать кровь на коагулологические исследования.

Однако такой способ взятия крови применим только в тех случаях, когда в катетер не вводился гепарин. Если же через этот катетер гепарин вводился, то удаляют до 20 мл крови, а затем берут кровь на исследование гемостаза.

Тем не менее, даже в этом случае приоритет должны получать гепарин-независимые тесты (ПВ, рептилазное время, фибриноген, фибрин-мономеры, антитромбин), так как сохраняется высокая вероятность влияния следов гепарина на такие тесты, как АЧТВ, тромбиновое время.

Факторы, влияющие на результат исследования

На состав крови, число клеток, состав белков и белково-связывающих макромолекул влияет положение тела больного. Уровень этих показателей всегда выше в положении стоя, так как при этом часть жидкости из сосудистого ложа переходит в окружающие ткани. При переходе в положение сидя, а особенно в положение лежа, жидкость быстро возвращается в сосуды («разведение крови»). Этот эффект в большей степени выражен у пациентов с отеками. У

здоровых людей через 8 ч лежания в постели концентрация фибриногена и активность антитромбина в крови примерно на 20% ниже, чем после 1 ч в положении стоя. У больных с отеками эта разница будет еще больше. Поэтому при мониторинге за состоянием пациента кровь всегда нужно брать в одном и том же положении пациента.

Физическая нагрузка и эмоциональные переживания сопровождаются изменениями плазменного гемостаза, фибринолиза и функции тромбоцитов. После серии приседаний в плазме увеличивается содержание ф. Виллебранда, у спортсменов после бега на 10 км содержание ф.VIII повышается на 60%, укорочивается АЧТВ, активируется фибринолиз. Аналогичные изменения наблюдаются у пациентов, перенесших эмоциональный стресс.

Влияние факторов преаналитического этапа на показатели плазменного гемостаза представлено в таблице 4.

33

Таблица 4.

Влияние факторов преаналитического этапа на показатели плазменного гемостаза

(по В.В. Долгову и П.В. Свирину)

Алкоголь влияет на показатели системы гемостаза в зависимости от дозы. После приема алкоголя наблюдается уменьшение антитромбина и фибриногена, повышение ингибитора активатора плазминогена и уменьшение времени кровотечения. Хронический алкоголизм сопровождается уменьшением количества тромбоцитов и нарушением их агрегации, которые, однако, достаточно быстро восстанавливаются после выхода из запоя.

Курение приводит к увеличению агрегации тромбоцитов и их адгезии, повышению в- тромбоглобулина, t-PA, активности PAI-1 и фибриногена, снижению ф.VII.

Подбор и влияние антикоагулянта на результат исследования

Материалом для коагулологических исследований является плазма, смешанная с антикоагулянтом, вызывающим обратимое связывание ионов кальция и препятствующим свертыванию. В качестве антикоагулянта в настоящее время используют натрий лимоннокислый (цитрат). Применяемый ранее оксалат натрия в натоящее время не применяется, т.к. он влияет на активность факторов свертывания.

Цитрат натрия обладает специфической способностью стабилизировать лабильные факторы свертывания (V и VIII). Это делает цитрат натрия антикоагулянтом выбора для коагулологических исследований. В соответствии с рекомендацией ВОЗ концентрация цитрата должна быть 109 ммоль.

Обычно рекомендуется для получения цитратной плазмы кровь смешать с 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. Но это соотношение верно только при показателе гематокрита 40-45%. На самом деле для получения точных и сравнимых результатов соотношение антикоагулянта и крови должно варьировать в зависимости от величины гематокрита (таблица 5). Это связано с тем, что раствор цитрата взаимодействует с плазмой и не проникает в клетки крови. Большее количество антикоагулянта по отношению к плазме может вызвать удлинение ПВ и АЧТВ.

34

Может быть допущена неточность при приготовлении раствора стабилизатора. Важно учесть, что трехзамещенный 5,5-водный цитрат натрия готовится в концентрации 3,8% (3,8 г на 100 мл дистиллированной воды; 0,11 моль), а 2-водный - в концентрации 3,2% (3,2 г на 100 мл воды; 0,11 моль). Хранение раствора цитрата допускается в течение 1 недели при температуре 2-8 °С, более длительное хранение приводит к бактериальному загрязнению и снижению концентрации цитрата натрия.

Избежать ошибок при приготовлении антикоагулянта можно, используя концентрат для приготовления консерванта для взятия крови, выпускаемый фирмами, специализирующимися на изготовлении наборов реакгентов для исследования гемостаза. Кроме того, наличие концентрата позволяет быстро приготовить требуемую концентрацию антикоагулянта.

Достаточно частой ошибкой при взятии крови является плохое или недостаточное перемешивание ее со стабилизатором. Для предотвращения этого следует немедленно после заполнения пробирки кровью до требуемого объема закрыть ее крышкой (не резиновой) или чистой полиэтиленовой пленкой и 2-3 раза медленно перевернуть. Нельзя трясти пробу, так как это может вызвать денатурацию белков и активацию тромбоцитов, не следует допускать образования пены.

Для восстановления способности свертываться к цитратной плазме добавляют определенное количество хлорида кальция (рекальцификация). Причиной изменения времени образования сгустка может стать несоответствие добавляемого кальция содержанию цитрата: коагулологические исследования являются более чувствительными к избытку кальция в плазме (высокий гематокрит, слишком мало крови), чем к его недостатку (низкий гематокрит, слишком много крови).

Хранение, доставка и пробоподготовка

Сразу же после взятия крови происходит изменение активности компонентов системы свертывания и фибринолиза. В пробе, не закрытой пробкой, возрастает рН из-за потери СО2. Следствием этого является увеличение времени свертывания. В пробе крови, хранящейся при комнатной температуре и закрытой пробкой, не происходит заметных изменений в результатах ПВ и АЧТВ.

Согласно международным рекомендациям срок доставки проб в лабораторию (ARUP Laboratories, 2002) для исследования показателей гемостаза не должен превышать 45 минут. Стабилизированную кровь до центрифугирования (в том числе и в процессе транспортировки) хранят при комнатной температуре (18-25 °С). Транспортировка крови на большие расстояния и ее частое встряхивание искажают результаты исследования. Кровь нельзя хранить во льду (что делается в некоторых клиниках), так как это может привести к холодовой активации ф. VII (процесс запускается через контактную фазу и развивается достаточно часто) и вызвать значительные изменения функции тромбоцитов.

В лаборатории для исследования гемостаза используют два типа плазмы крови: плазму, бедную тромбоцитами, и плазму, богатую тромбоцитами.

35

Плазму, богатую тромбоцитами, получают центрифугированием цитратной крови в течение 5-10 мин при 1000-1500 об/мин (450-500 g).

Плазму, бедную тромбоцитами, получают двойным центрифугированием: сначала получают плазму, богатую тромбоцитами, а затем плазму, богатую тромбоцитами переносят в чистую пластиковую пробирку и еще раз центрифугируют в течение 15-20 мин при температуре 4° С при 3000-4500 об/мин (1200-2000 g).

Величину g - RCF (относительную центробежную силу) рассчитывают по формуле:

RCF = 1,118 x 10-5 x r x n2 ,

где: r – эффективный радиус вращения центрифуги – средний радиус от оси вращения (центра ротора) до дна пробирки;

n – скорость вращения в оборотах в минуту.

В описаниях разных авторов можно встретить несколько отличающиеся цифры. Эти расхождения не принципиальны. Для получения сопоставимых результатов следует только строго соблюдать однажды выбранный в лаборатории режим центрифугирования. Если пробы необходимо заморозить перед проведением теста, то после размораживания рекомендуется повторно отцентрифугировать пробу и работать с супернатантом. Это делается для удаления остатков разрушенных тромбоцитов, фосфолипидов и белков их мембран, которые могут влиять на некоторые коагуляционные тесты.

После проведения всех подготовительных процедур следует перейти к пробоотбору – удалению неправильно взятых образцов для исключения ошибок, связанных с преаналитическими погрешностями.

Неправильное соотношение кровь/цитрат можно определить, если объем крови в пробирке меньше или больше, чем требуемый. При малом объеме крови будет зарегистрировано ложное удлинение коагуляционных тестов.

Пробы с видимыми сгустками фибрина. В зависимости от степени свертывания коагуляционные тесты могут быть укорочены, нормальны или удлинены. В ряде случаев (сомнительные результаты) после отделения плазмы рекомендуют аккуратно вылить оставшуюся в пробирке плазму и форменные элементы в чашку Петри для определения наличия сгустков.

Гемолиз может произойти при хранении цельной крови или после центрифугирования. В таких тестах результаты варьируют в зависимости от степени гемолиза. Если гемолиз произошел после взятия крови, то такие образцы следует отбросить, чтобы не получить ложных результатов. Если гемолиз присущ in vivo, что подтверждается взятием нового образца, то тесты могут выполняться для оценки гемостатической ситуации с учетом возможных погрешностей.

Все пробы, которые дадут заведомо ложные показания, должны быть удалены (выбракованы), а клиницисты должны быть немедленно об этом информированы, т.к. в ряде случаев необходимо повторение взятия биоматериала.

ИССЛЕДОВАНИЕ ТРОМБОЦИТОВ

Количество тромбоцитов (число тромбоцитов; Platelets, PL, PLT) Подсчет тромбоцитов на гематологическом анализаторе.

На сегодняшний день методом выбора при исследовании тромбоцитов является их определение на автоматическом анализаторе. Автоматические счетчики позволяют получать достаточно надежные результаты при определении количества тромбоцитов.

При подсчете тромбоцитов по Фонио коэффициент вариации находится в пределах 20%, в камере Горяева – составляет 7-15%, тогда как автоматический подсчет воспроизводится с точностью до 2-4%.

Современные анализаторы сигнализируют о выходе количества тромбоцитов за референтные пределы, наличии агрегатов тромбоцитов, макротромбоцитов или других элементов, сравнимых по объему с тромбоцитами (микроэритроциты), что существенно облегчает трактовку получаемых результатов.

В то же время следует иметь в виду, что в отличие от ручного подсчета тромбоцитов, где проводится предварительный лизис эритроцитов, автоматические счетчики крови анализируют тромбоциты и эритроциты в одной камере без предварительной обработки. Тромбоциты распознаются по размерам в диапазоне 2-20 фл. Это создает проблему дифференцирования больших форм тромбоцитов (макротромбоцитов) и сравнимых с ними по объему эритроцитов (микроцитов), их фрагментов (шизоцитов), а также отшнуровавшихся фрагментов цитоплазмы лейкоцитов (клеточный дебрис).

Ложное занижение числа тромбоцитов может быть при их агрегации, агглютинации под действием тромбоцитарных агглютининов и при прилипании тромбоцитов к лейкоцитам (тромбоцитарный «сателлитизм»). При подсчете на гематологических анализаторах в качестве

36

антикоагулянта используется ЭДТА. При наличии аутоантител к тромбоцитам калиевая соль ЭДТА инициирует агрегацию тромбоцитов, что проявляется псевдотромбоцитопенией.

Нормальные величины. Количество тромбоцитов у здоровых людей составляет 180 - 320 х 109/ë.

Клиническое значение

Снижение количества PLT в крови - тромбоцитопения - может развиваться: · в результате снижения продукции PLT:

наследственные: синдром Франкони (Фанкони), врожденная тромбоцитопения, краснуха новорожденных, гистиоцитоз,

приобретенные: лейкозы, миелодиспластические синдромы, миелофиброз, метастазы новообразований в костный мозг; дефицит витамина В12 и фолиевой кислоты (мегалобластные анемии), ночная пароксизмальная гемоглобинурия, вирусные инфекции, интоксикации, наследственные аномалии, ионизирующее облучение, прием миелодепрессивных препаратов, циклическая тромбоцитопения, почечная недостаточность.

· в результате повышения деструкции PLT:

инфекции (значительное, иногда катастрофическое снижение PLT, наблюдается при Конго-Крымской геморрагической лихорадке), эклампсия беременных, гемолитико-уремический синдром (ГУС), ВИЧ-инфекция, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, системная красная волчанка, хронический лимфолейкоз, хронический активный гепатит, посттрансфузионная тромбоцитопения; гемодиализ, кровотечения, разрушение в селезенке (гиперспленизм при болезнях накопления, лимфомах, волосатоклеточном лейкозе, миелопролиферативных заболеваниях, портальной гипертензии);

· в результате потребления PLT:

синдром ДВС.

Клинико-диагностическое значение тромбоцитопений и иммунных тромбоцитопений приведены также в таблицах 6 и 7.

37

Повышение количества PLT в крови - тромбоцитоз - характерно для миелопролиферативных заболеваний. Тромбоцитоз наблюдается также при злокачественных новообразованиях, после операций, при воспалительных заболеваниях (острый ревматизм, ревматоидный артрит, туберкулез, остеомиелит), после спленэктомии, циррозе печени, кровотечениях, в период выздоровления при мегалобластных анемиях, лечении кортикостероидами, остром гемолизе, физических перенапряжениях. См. также таблицу 8.

Средний объем тромбоцита (MPV)

У здоровых людей MPV равен 6-12 фл и находится в обратной зависимости от числа тромбоцитов. MPV увеличивается с возрастом. У мужчин MPV несколько выше, чем у женщин.

Использование ЭДТА в качестве антикоагулянта вызывает изменение формы тромбоцитов от диска к сфере, что приводит к увеличению MPV на 10-12% в течение 2 часов, а затем показатель существенно не меняется. Под действием цитрата натрия MPV может уменьшаться или увеличиваться, а при высокой концентрации (1:4) - не изменяется со временем. Кроме типа применяемого антикоагулянта и времени от момента взятия пробы до исследования, на MPV оказывает влияние температура окружающей среды. Преходящее увеличение MPV отмечается у рабочих, контактирующих с асфальтовыми испарениями, органическими растворителями. MPV - важный диагностический показатель функции тромбоцитов.

38

PDW - показатель, являющийся мерой гетерогенности размеров (анизоцитоза) тромбоцитов. Величина PDW в среднем составляет 10-15%.

Как артефакт, ложно завышенное увеличение PDW может быть связано с присутствием микроцитов, шизоцитов, микроагрегатов тромбоцитов, фрагментов цитоплазмы лейкоцитов.

Этот показатель находится в обратной зависимости от числа тромбоцитов и их периода жиз-ни. В каждом конкретном случае важна не только величина PDW, но и ее динамика во времени, а также связь с другими тромбоцитарными показателями. Так, увеличение PDW с одновременным снижением MPV свидетельствует о преобладании микротромбоцитов среди общей популяции тромбоцитов (указывает на угнетение тромбоцитопоэза), а сочетание повышенного PDW с увеличением MPV отражает нарастание числа макротромбоцитов (усиление продукции тромбоцитов). Одновременное присутствие фракций макротромбоцитов и микротромбоцитов ведет к увеличению PDW, но MPV может оставаться в пределах нормы. В современных гематологических анализаторах отдельными показателями указывается процентное содержание микротромбоцитов (MicroPLT) и макротромбоцитов (MacroPLT).

PDW может применяться для дифференциальной диагностики. Так, увеличение PDW свыше 15% было обнаружено у 50% больных эссенциальной тромбоцитемией, у 21% пациентов с реактивным тромбоцитозом и лишь у 14% здоровых людей.

РСТ - показатель, характеризующий процент тромбоцитарной массы в объеме крови: вычисляется суммированием прямо измеренных объемов тромбоцитов или произведением среднего объема тромбоцитов на их число.

У здорового человека показатель стремится остаться стабильным: при уменьшении числа тромбоцитов усиливается тромбопоэз, в циркулирующую кровь выбрасывается большее число молодых макротромбоцитов, что ведет к увеличению MPV. При увеличении количества циркулирующих тромбоцитов снижается продукция их в костном мозге, тем самым уменьшается процент макротромбоцитов и MPV уменьшается. Однако при нарушении этого равновесия происходит или уменьшение РСТ, что, в конечном счете, приводит к патологии первичного гемостаза и риску возникновения кровотечений, или повышение РСТ, увеличивающее активность тромбоцитов и их способность к агрегации. Это повышает риск тромбозов.

Нормальные значения РСТ варьируют в пределах 0,15-0,35%. Было обнаружено, что снижение РСТ менее 0,1% обусловило возникновение послеоперационных кровотечений у пациентов с развившейся тромбоцитопенией. Также было отмечено, что этот показатель оказался более чувствительным для оценки риска возникновения кровотечения, чем число тромбоцитов.

Если скрининговые методы указывают на нарушение функции тромбоцитов, необходимо выполнить специальные тесты с учетом диеты и лекарственных препаратов, принимаемых пациентом (отмена за 7-10 суток перед исследованием глюкокортикостероидов, аспирина и других нестероидных противовоспалительных средств, адреноблокаторов, блокаторов кальциевых каналов, антиагрегантов: пентоксифиллина, папаверина, теофиллина, дипиридамола, тиклопидина, антибиотиков - пенициллина, карбенициллина).

Время свертывания крови

Унифицированный метод определения времени свертывания крови (метод Ли-Уайта)

Реактивы и оборудование. Водяная баня, секундомеры.

Материал для исследования. Цельная нестабилизированная венозная кровь.

Ход определения. Сухой иглой с широким просветом без шприца пунктируют локтевую вену. Выпустив первые капли крови на ватный тампон, набирают по 1 мл в сухую пробирку. Немедленно включают секундомер и ставят пробирку в водяную баню при температуре 37 градусов. Через 2 мин, а затем каждые 30 сек, пробирки наклоняют на 45-60 градусов, дожидаясь момента, когда кровь свернется. Отмечают время свертывания крови.

Нормальные величины. 5-10 минут.

Клиническое значение. Удлинение времени свертывания крови до 15 мин и более наблюдается при тяжелой недостаточности факторов, участвующих во внутреннем пути образования протромбиназы, дефиците протромбина и фибриногена, а также при наличии в крови ингибиторов свертывания.

39

НАБОРЫ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ПАРАМЕТРОВ ГЕМОСТАЗА, ИЗГОТАВЛИВАЕМЫЕ НПО «РЕНАМ» МБООИ «ОБЩЕСТВО БОЛЬНЫХ ГЕМОФИЛИЕЙ»

ИССЛЕДОВАНИЕ ТРОМБОЦИТОВ И ФАКТОРА ВИЛЛЕБРАНДА

Набор реагентов для исследования агрегационной активности тромбоцитов (АГРЕНАМ)

Набор реагентов АГРЕНАМ предназначен для определения агрегационной функции тромбоцитов крови человека с помощью 3 индукторов агрегации: АДФ, коллагена и ристоцетина. Исследование проводят с целью диагностики повышенной агрегационной активности тромбоцитов, приводящей к инфаркту миокарда, ишемической болезни сердца и пр., или сниженной агрегационной активности, вызванной врожденной (тромбастения Гланцманна, синдром Бернара-Сулье) или приобретенной (лейкоз, уремия, ДВС-синдром и пр.) тромбоцитопатией.

Набор предназначен для проведения 40 определений с АДФ и 20 с коллагеном или ристоцетином при использовании количественного экспресс-метода или 120 определений с АДФ и 32 определения

ñколлагеном и ристоцетином при использовании количественного турбидиметрического метода.

Âнормальной плазме здоровых лиц уровень агрегационной активности тромбоцитов составляет 50-75%.

Принцип метода

Исследуемую плазму, обогащенную тромбоцитами, смешивают с одним из индукторов агрегации на предметном стекле (экспресс-метод) или в кювете агрегометра (турбидиметрический метод). В первом случае отмечают время появления агрегатов, во втором – регистрируют графически, путем записи агрегатограммы, возрастание светопропускания в результате потребления тромбоцитов в агрегатах, образующихся под действием индукторов. По агрегатограмме определяют степень агрегации, время агрегации и скорость агрегации.

Состав набора

1.АДФ лиофильно высушенный, 0,2 мМ (2 · 10-4 Ì) – 2 ôë.

2.Коллаген лиофильно высушенный, 0,2% – 2 фл.

3.Ристоцетин лиофильно высушенный, 1,5% – 2 фл.

Анализируемые образцы

Венозную кровь смешать с 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 4:1 для экспресс-

метода и в соотношении 9:1 для турбидиметрического метода. Кровь со сгустками и с гемолизом, а также полученную более 2 ч назад не использовать.

Сразу же после забора крови провести центрифугирование для получения обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) и бедной тромбоцитами плазмы (БТП).

ОТП получить центрифугированием цитратной крови в течение 9 мин при комнатной температуре (18-25°С) и при скорости вращения 1000-1500 об/мин (140-160 g). Количество полученных тромбоцитов должно находиться в пределах 200-500 х 109/л. Подсчет числа тромбоцитов провести с помощью агрегометра, счетчика клеток или микроскопически в камере Горяева.

БТП получить центрифугированием цитратной крови в течение 20 мин при комнатной температуре и при скорости вращения 3000-4000 об/мин (1200-1400 g).

Немедленно после завершения центрифугирования перенести ОТП и БТП в другие пробирки. Использовать для анализов не позднее, чем в течение 2 ч после сбора крови.

Проведение экспресс-анализа по Шитиковой

На обезжиренное предметное стекло нанести по 0,05 мл ОТП и 0,05 мл одного из активаторов, смешать при покачивании, включить секундомер. Отметить время появления агрегатов при рассматривании на темном фоне при боковом освещении. Каждое определение повторить не менее 3 раз, рассчитать среднюю арифметическую величину скорости появления агрегатов.

Âнормальной плазме здоровых лиц время появления агрегатов на индукцию АДФ и коллагеном

-10-15 сек, на индукцию ристоцетином – 5-10 сек. Удлинение времени агрегации на 10-20 сек указывает на нарушение функций тромбоцитов, укорочение времени агрегации - на повышенную функцию клеток. Полное отсутствие агрегации под действием АДФ и коллагена свидетельствует о тромбастении Гланцманна, под действием ристоцетина – о синдроме Бернара-Сулье или болезни Виллебранда I или III типов.

Нормальные значения агрегационной активности тромбоцитов здоровых лиц рекомендуется установить в каждой диагностической лаборатории применительно к имеющемуся оборудованию и реагентам.

40