6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_нарушений_гемостаза_В_В_Долгов,_П_В_Свирин

Рис. 83. Принцип работы механического коагуломет-

ра. Кювета с плазмой расположена под наклоном и вращается, шарик стоит на месте, не вращается. В момент свертывания шарик захватывается сгустком; как только шарик уходит от датчика, меняется магнитное поле, прибор регистрирует момент свертывания плазмы

Турбидиметрические коагулометры

Турбидиметрические коагулометры регистрируют момент свертывания крови по приросту оптической плотности (рис. 85). При свертывании плазмы происходит резкое изменение светопропускания или рассеивания. В коагулометре программируется, при каком приросте

Рис. 84. Принцип регистрации выпадающего фибрина оптико-механическим коагулометром. Выпавшие в кювете нити фибрина меняют световой поток, падающий на фотодиод. Фотодиод связан через следящую схему компенсации с напряжением на лампе. В результате на лампу подается такое напряжение, которое меняет яркость свечения лампы, чтобы световой поток, попадающий на светодиод, поддерживался в заданном диапазоне. По изменению напряжения на лампе регистрируется начало выпадения фибринового сгустка

оптической плотности по отношению к исходному уровню ( А) регистрируется момент свертывания. Время от внесения в оптическую кювету индуктора свертывания до момента достижения заданного А определяется как время свертывания плазмы в исследуемом тесте. Турбидиметрический принцип используется при определении показателей свертывания плазмы на многофункциональных фотометрах и биохимических анализаторах. Фотометрический канал при этом программируется по методу«время достижения фиксированной величины абсорбции». Программы для исследования гемостаза стали использовать даже на многофункциональных плашечных фотометрах, в которых свертывание плазмы исследуется на стриппах или планшетах.

Основными преимуществами оптических систем измерения являются:

1.Более точные результаты измерений при низ ких показателях свертывания. Полностью исключена проблема «слабого сгустка».

2.Исключено загрязнение пробы, так как отсут ствуют мешалки и другие механические ком поненты.

3.Имеется возможность снижения объема про бы, так как не нужно место под механичес кие компоненты (мешалки), это важно, осо бенно в педиатрии. Кроме того, уменьшает ся расход реагентов.

4.Эргономичность и удобство работы. Типичным представителем этого семейства

приборов является оптический двухканальный коагулометр KG-1 производства компании «Согmау» (рис. 86).

Рис. 85. Принцип регистрации момента образования сгустка турбидиметрическим коагулометром. При свер-

тывании плазмы происходит резкое увеличение оптической плотности в фотометрической ячейке. Коагулометр определяет время от внесения активатора свертывания до момента изменения оптической плотности на ДА(например, на 0,1 ед. оптической плотности)

Нефелометрические коагулометры определяют момент образования сгустка по изменению рассеяния света. Новейшие разработки в этой области технологий нашли воплощение в коагулометрах фирмы «Sysmex» (Япония), в которых используется принцип определения сгустка по боковому рассеиванию света (рис. 87). Метод рассеивания обеспечивает высокое качество анализов - высокую специфичность и чувствительность метода детекции сгустка даже для сложной липемичной или иктеричной плазмы.

Применение синтетических хромогенных субстратов явилось прорывом при исследовании отдельных ферментов или ингибиторов, которые не учитываются простыми коагуляционными тестами или очень трудны для стандартизации. Во многих случаях хромогенные субстраты являются специфичными и позволяют определить протеолитическую активность отдельных компонентов плазменного гемостаза и их ингибиторов. Эти тесты схожи с тестами клинической химии, поэтому легко автоматизируются и могут выполняться на биохимических анализаторах как в клинико-диагнос- тических, так и в научных лабораториях.

Принцип тестов с хромогенными субстратами представлен на рис. 89. Протеаза расщепляет короткоцепочечный пептид (из 3-10 аминокислот), к которому через эфирную связь пришит хромоген (в нашем случае паранитроанилинpNA). Комплекс пептид-pNA имеет максимум поглощения в области короткого ультрафиолета, свободный pNA - при 380 нм. Итоговая концентрация pNA пропорциональна активности протеазы и определяется по увеличению поглощения светового пучка с длиной волны 405 нм.

Рис. 89. Принцип определения активности протеолитического фермента (протеазы) с использованием хро-

могенного субстрата. Максимум поглощения паранитроанилина, связанного с пептидом, находится в области короткого ультрафиолета, а свободного паранитроанилина380 нм, При длине волны 405 нм поглощает практически только свободная форма хромогена, на этой длине волны проводится регистрация протеолитической реакции

Иммунохимические методы активно начали внедряться в клинико-диагностических лабораториях с целью исследования гемостаза в последнее десятилетие. Они позволяют количественно определять концентрацию конкретного белка, что отличает их от коагуляционных методов и методов с хромогенными субстратами, в которых определяется функциональная активность компонентов, а не их концентрация. Первые тест-сис- темы не позволяли различить активные и неактивные (профакторы) компоненты системы гемостаза. В последнее время предлагается все больше тест-систем для определения концентрации активных компонентов свертывания, их кофакторов, активаторов, ингибиторов, продуктов протеолитического гидролиза, а также сформировавшихся субстрат-ферментных комплексов. Эти тесты основаны на использовании специфических антител. В современных клинико-диагностичес- ких лабораториях доступными стали иммунохимические методы для ручного и автоматизированного использования, основанные на латекс-агг- лютинации (рис. 90) и методе ELISA (EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay).

Латекс-агглютинация

Латекс-агглютинация выявляется визуально или на автоматизированных нефелометрах. Не-

достатком этого подхода является нелинейность оптического сигнала при турбидиметрическом и нефелометрическом методах регистрации.

Метод ELISA

Метод ELISA (рис. 91) для выявления концентрации факторов гемостаза, как правило, использует принцип «сендвича». На стенки микроплашки наносятся антитела к исследуемому фактору гемостаза (твердая фаза). После добавления плазмы происходит осаждение специфического антигена (белка системы гемостаза) на фиксированных антителах. Плашка промывается и заполняется вторичными антителами, взаимодействующими с этим же белком, но по другим эпитопам (антигенным структурам). Вторичные антитела конъюгированы с ферментом (ELISA), радиоактивной меткой (РИА), люминесцентной меткой (ЛИА). В тесте ELISA после отмывки несвязавшихся антител добавляется субстрат ферментативной реакции и хромоген. Изменение светопропускания раствора пропорционально количеству антигена (фактора), осажденного на фиксированных антителах. Методика позволяет оценить этот параметр количественно в концентрации <1 нг/мл, что достаточно для многих компонентов свертывающей системы.

Рис. 90. Принцип латекс-агглютинации. Латексные час-

тицы, покрытые антителами против фактора гемостаза, при взаимодействии с этим фактором(антигеном) образуют агрегаты, видимые визуально или регистрируемые на соответствующих приборах

Рис. 91. Принцип ELISA. На плашке, покрытой антителами против фактора гемостаза, связывается антиген, Проявляющие антитела, конъюгированные с ферментом, связываются с антигеном. Фермент меняет цвет хромогена пропорционально количеству антигена

В настоящее время значительное развитие получают быстрые качественные и полуколичественные иммунохимические иммунодиффузионные методы, основанные на визуальном определении реакции антиген-антитело.

Радиальная иммунодиффузия

Метод радиальной иммунодиффузии (РИД) основан на образовании колец преципитации в результате взаимодействия специфических антител, содержащихся в геле, с анализируемым антигеном, помещаемым в углубления стандартного размера (рис. 92). В результате диффузии в геле растворимых антигенов кольцо преципитации образуется в зоне оптимального соотношения антиген/антитело. Площадь, ограниченная кольцом преципитации, пропорциональна количеству антигена.

«Ракетный» иммуноэлектрофорез

«Ракетный» иммуноэлектрофорез - иммунологический метод, сочетающий в себе электрофорез и иммунодиффузию (рис. 93). Метод дает возможность различить сходные по электрофоретической подвижности вещества с помощью специфической реакции преципитации между антигеном, помещаемым на гелевую (целлюлозо-ацетатную) пластинку, и соответствующими антителами, которые содержатся в ней. Длина «ракетных» иммунопреципитатов пропорциональна концентрации антигена. Метод довольно прост в исполнении и обладает относительно высокой точностью.

При фундаментальном подходе к исследованиям компонентов гемостаза применение флуоресцентной или люминесцентной меток повышает чувствительность иммунохимических методов и расширяет спектр определяемых компонентов.

Лабораторная диагностика нарушений системы гемостаза является одной из самых дорогостоящих в лабораторной практике. Выполнение всех возможных тестов для уточнения характера нарушений для всех пациентов - практически недоступная задача. Поэтому чрезвычайно важно соблюдать этапность проведения тестов, исходить из клинических данных и анамнеза пациента.

На первом этапе для уточнения направленности нарушений необходимо провести тесты, отражающие состояние целых звеньев системы гемостаза. Поскольку в разных лабораториях при анализе гемостаза преследуются разные цели, перечень тестов, входящих в гемостатический скрининг для данной лаборатории, может отличаться от такового в дру-

гих лабораториях. Однако существует набор тестов, традиционно называемых (и рекомендуемых) скрининговыми для диагностики состояния системы гемостаза. Обычно к ним относят определениевремени кровотечения и несколько тестов, оценивающих состояние плазменного звена гемостаза, которые входят как основной компонент в понятиекоагулограммы. Наиболее полно этапность разработана для диагностики геморрагических нарушений. Скрининговые тесты:

•Время кровотечения.

•Количество тромбоцитов.

•АЧТВ.

•Протромбиновое время (по Квику).

•Тромбиновое время и/или фибриноген.

Рис. 95. Последовательные и взаимовлияющие реак-

ции, определяющие значение активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ)

пробы зависит от применяемых пробирок. Поэтому каждая лаборатория должна нарабатывать собственные нормы. До настоящего времени практически нет системы межлабораторной стандартизации теста АЧТВ, приборная и реагентная база этого теста пока не поддаются стандартизации. Рекомендуется корректировать нормы для каждой серии реактивов. Опытным путем следует удостовериться в качестве АЧТВреактивов, которые должны отвечать следующим критериям:

•Иметь одинаковые диапазоны нормальных значений для разных серий реактивов от од ного производителя.

•Должны выявлять клинически значимое сни жение факторов свертывания удлинением времени образования сгустка (т. е. результа ты должны соответствовать клиническим проявлениям гипокоагуляции).

•Быть чувствительными к антикоагулянтному эффекту гепарина, при этом не проявлять слишком высокой чувствительности при ис пользовании гепарина в терапевтической концентрации.

•Выявлять наличие волчаночного антикоагу лянта, для этого рекомендуется использовать, в частности, 2 набора с разной чувствитель ностью к волчаночному антикоагулянту.

Предпочтительно использовать готовые реактивы, что уменьшает ошибку оператора.

Время преинкубации в тесте АЧТВ имеет большое значение для выявления патологии гемостаза. При коротком времени от момента добавления активаторов (каолин и кефалин) до момента внесения СаС12 тест АЧТВ получается достаточно длительным и нестабильным. Опыт показывает, что 30 с преинкубации недостаточно, однозначные стабильные результаты гарантированно получаются после 600 с преинкубации. Однако такая длительная преинкубация нетехнологична. Общепринятой считается преинкубация 60 с, при которой нестабильность не приводит к искажениям результатов, которые бы значимо влияли на диагностические характеристики теста.

Тем не менее при дефицитной плазме по одному из факторов контактной фазы(XII, XI, прекалликреин, ВМК), особенно прекалликреину, длительная фаза преинкубации с активаторами создает условия для нивелирования результатов. Только при коротком периоде преинкубации в этих условиях удается выявить дефицит фактора, при 60-минутной преинкубации часто дефицит факторов контакта не выявляется. Результаты будут ложно «нормальными», что ведет к ошибочному диагнозу.

Диагностическое значение АЧТВ

Укорочение А ЧТВ иногда определяется у больных с тромбофилией. Это может быть связано с резистентностью фактора V к активному протеину С, повышенным уровнем фактора VIII или активированных факторов свертывания. Однако чаще всего укорочение АЧТВ объясняется нарушениями работы с кровью на преаналитическом этапе.

Удлинение А ЧТВ происходит при:

•врожденном или приобретенном дефиците факторов II, V, VIII, IX, X, XI, XII, прекал-

ликреина, ВМК;

•снижении активности ф-VIII на фоне болез ни Виллебранда;

•лечении гепарином, гирудином или апротинином (ингибитор контактной фазы коагу ляции);

•присутствии в крови ПДФ, волчаночного антикоагулянта;