2.3.3. Иммунологическое исследование
Иммунологическое исследование крови проводили для определения количества CD3+, CD4+ Т-лимфоцитов у пациентов методом проточной цитометрии с использованием трехцветного флуоресцентного реагента Becton Dickinson TriTEST CD3 FITC/ CD4 PE/ CD45 PerCP. Абсолютное количество клеток определяли с помощью программного обеспечения MultiSET.
2.3.4. Серологические исследования
Для выявления и количественного определения РНК вируса иммунодефицита человека и РНК вируса гепатита С, в сыворотке крови использовали метод ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Диапазон определяемых концентраций (область линейности): от 100 МЕ/мл до 108 МЕ/мл
РНК ВИЧ при выделении РНК из 1 мл пробы (или от 1000 МЕ/мл до 109 МЕ/мл – привыделении РНК из 100 мкл пробы). Для определения вирусной нагрузки в копиях РНК ВИЧ на мл применяли соотношение 1 МЕ = 0,58 копии РНК ВИЧ (WHO 2nd International Standard HIV-1 RNA NIBSC code: 97/650).
2.3.5. Микологическое исследование
Лабораторная диагностика дерматомикозов включала микроскопию, посев и определение рода и вида возбудителя. С предварительно обработанных 70% этиловым спиртом кожи и ногтей, производили забор образцов биосубстратов (кожные чешуйки с периферических участков мест поражений, покрышки пузырьков и пузырей, волосы, ногтевые чешуйки из глубоких слоев пораженной ногтевой пластинки и др.), готовили препараты (помещали в пробирку и оставляли в 20% растворе KOH в течение 30 – 60 минут). Готовый препарат на предметном стекле накрывали покровным стеклом и микроскопировали при малом и большом увеличении. Отмечали наличие септированного и несептированного мицелия, почкующихся клеток – псевдомицелия, а также округлых почкующихся клеток в виде гроздьев и коротких септированных, слегка изогнутых, иногда ветвящихся гиф микромицетов.
Патологический материал культивировали на картофельном агаре при 28оС.
Появление роста дерматомицетов и недерматомицетных нитчатых грибов отмечали с 4-го по 12-й день инкубации до 30 дней, дрожжевых грибов – со 2-го по 5-й день. При отсутствии роста в течение месяца результаты культивирования считались отрицательными. Идентификацию полученных культур проводили с учетом роста колоний и по микроморфологическим признакам. В работе использовали «Определитель патогенных и условно-патогенных грибов» (пер. с англ.: Саттон Д., Фоторгилл А., Ринальди М., 2001 г.). Для определения вида возбудителя кандидоза применяли тест на ростковые трубки и хромогенный агар
(Plate of HiCrom Candida Differetial Agar – M1297А производства компании
HiMedia) и тест-систему «Auxacolor 2» (BioRad).
2.4. Статистические методы анализа результатов исследования
Статистическая обработка результатов включала создание базы данных, автоматизированную проверку качества подготовки информации и статистический анализ.
Статистический анализ полученных данных проводили с использованием пакета программ Statistica 6.0 А (А.Е. Платонов, 2000; В. Боровиков, 2003).
Результаты исследования были обработаны методом вариационной статистики с определением критерия χ² (кси-квадрат), критерия Фишера (F) для оценки непараметрических показателей групп малых выборок и параметрические методы сравнения средних величин и относительных показателей с применением критерия Стьюдента (t). Во всех случаях определялись среднее арифметическое (М), среднее квадратичное отклонение (σ), стандартная ошибка среднего значения
(m).
В основе определения достоверности различий показателей заболеваемости в сравниваемых группах явилось вычисление критерия достоверности (t):
t = (IR1 – IR2)//m12 + m22 ,
IR1, IR2 – коэффициент заболеваемости в сравниваемых группах;
m1, m2 - средние ошибки показателей заболеваемости в сравниваемых группах. В большинстве медицинских исследований достаточно иметь значение критерия достоверности (t), равное или больше 2, что соответствует 95 % достоверности.
В качестве показателя, характеризующего различия в уровне заболеваемости между группами использовали величину показателя
«относительного сравнения» - относительного риска (RR): RR = IR1/IR0, где IR1- коэффициент заболеваемости в основной группе; IR0 - коэффициент заболеваемости в контрольной группе.
Для характеристики точности полученных значений RR определяли 95%
между группами по формуле:
eln (R R ) 1 ,9 6 v ar{ln (R R })
, где знаком минус обозначалась
нижняя граница, а знаком плюс – верхняя граница; е – основание натурального
основанию е;
var{lv(RR)
(N - A)/(N A)
(N0
A0 ) /( N0
A0 ),
где N – численность
основной группы наблюдения; No - численность контрольной группы наблюдения; А – число выявленных случаев заболевания в основной группе; Ao - число выявленных случаев заболевания в контрольной группе (по Albom A., 1990) (Гланц – 26).
Для устранения половых и возрастных различий в группах наряду с расчетом интенсивных коэффициентов заболеваемости (IR int) применялся метод прямой стандартизации с применением мирового стандарта населения и расчетом стандартизованных коэффициентов заболеваемости (IR st).