2 курс / Гистология / Спектральные_методы_в_микроскопии_Колтовой_Н_А_Краевой_С_А_

Сведения об авторах:

Краевой Сергей Александрович, д.м.н. заместитель министра здравоохранения РФ.

Окончил Военно-медицинскую Ордена Ленина Краснознаменную Академию им. С.М. Кирова. Дополнительное образование:

повышение квалификации – МВА. «Каскадное обучение системе менеджмента качества и лидерства. Уровень «Руководитель качества».

Российская Академия Государственной службы при Президенте Российской Федерации «Социально-экономическая политика государства и пути ее реализации в здравоохранении». Российская Академия путей сообщения ФГБ ОУ ВПО МИИТ «Охрана труда на предприятиях железнодорожного транспорта» Дипломатическая академия Министерства Иностранных Дел Российской Федерации «Деловой протокол и этикет».

Институт усовершенствования врачей ФГУ «Национальный медико-хирургический центр им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России «Организация здравоохранения и общественное здоровье».

«НМХЦ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России программа «Организация здравоохранения и общественное здоровье»

Колтовой Николай Алексеевич (Москва) – окончил МФТИ с отличием, кандидат физикоматематических наук. Много лет проработал в представительстве фирмы Zeiss в Москве, председатель “Image Processing Club”. Специализация – оптика, микроскопия, системы анализа изображений, исследование биожидкостей, спектральные методы исследования в медицине, спектральные методы ранней диагностики рака, кристаллизация биожидкостей.

koltovoi@mail.ru

2

С.Краевой, Н.Колтовой Книга 9. Спектральные методы в микроскопии.

Аннотация.

Книга посвящена одному из самых сложных и малоизученных вопросов в микроскопии

– спектральные методы в микроскопии. Описываются различные методы построения комплексов для регистрации спектральных данных. Рассматриваются различные модели микроспектрофотометров. Приводятся алгоритмы обработки мультиспектральных данных. Подробно рассматривается вопрос применения спектральных методов в медицине для диагностики. Книга предназначена для специалистов, занимающихся микроскопией - медиков, биологов, научных работников.

Серия книг по кристаллизации биожидкостей и спектральным методам Книга 1. Кристаллизация сыворотки крови методом открытой капли (угловая дегидратация).

Книга 2. Кристаллизация сыворотки крови методом закрытой капли (краевая дегидратация). Книга 3. Тезиография. Кристаллизация тестовых растворов.

Книга 4. Кристаллизация различных биожидкостей.

Книга 5. Обзор литературы по кристаллизации биожидкостей. Книга 6. Структура и свойства воды.

Книга 7. Замораживание жидкостей.

Книга 8. Методы контрастирования в микроскопии. Книга 9. Спектральные методы в микроскопии.

Книга 10. Флуоресцентные методы. Хемилюминесценция. Книга 11. Флуоресцентные методы в медицине.

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------

S. Kraevoy, N. Koltovoy

Book 9. Spectral Methods in microscopy.

Abstract.

The book is dedicated to one of the most difficult and neglected issues in microscopy - microscopy transparent (not painted) objects. Describes the various methods of microscopy: forgotten the old ways, and created new methods of microscopy. The book is intended for professionals involved in microscopy - doctors, biologists and scientists.

Books about the problems of crystallization bioliquids and spectroscopy. Book 1. Crystallization of blood serum by means open drops evaporation. Book 2. Crystallization of blood serum by means closed drops evaporation. Book 3. Sensitive Cristallization. Crystallization test solutions.

Book 4. Crystallization of different bioliquids.

Book 5. Review of the literature on the crystallization bioliquids. Book 6. The structure and properties of water.

Book 7. Freezing liquids.

Book 8. Contrast Methods in microscopy. Book 9. Spectral Methods in microscopy. Book 10. Fluorescence. Chemiluminescence.

Book 11. Biomedical applications of fluorescence.

3

Оглавление.

Глава 1. Микроскоп – спектрофотометр. 5

1.1Спектральные методы контрастирования. 5

1.2Регистрация спектра в одной точке. 6

1.2.1Точечная регистрация. Монохроматическое освещение. 6

1.2.2Micro-spectroscope - микроскоп с призменным спектроскопом. 9

1.2.3Установка спектрофотометра на микроскопе. 14

1.2.4Соединение микроскопа со спектрофотометром с помощью оптоволокна. 19

1.3Двумерная спектроскопия путем поточечного сканирования. 21

1.4Двумерная спектроскопия. 24

1.4.1Двумерная регистрация. Монохроматическое освещение. 24

1.4.2Двумерная регистрация. Обычное освещение. 28

1.5Оптимизация получения спектральных данных. 34

1.6Обработка мультиспектральных данных. 36

1.6.1Задача сегментации многозональных изображений. 36

1.6.2Выделение границы на многозональном изображении. 38

1.6.3Распознавание объектов по спектральным данным. 39

1.6.4Программы для обработки мультиспектральных данных. 40

Глава 2. Применение спектральных методов. 41

2.1Применение спектральных методов в медицине. 41

2.1.1Изучение спектров поглощения живых клеток в среде. 41

2.1.2Изучение спектров окрашенных клеток на предметном стекле. 42

2.1.3Определение плоидности клеток. 42

2.1.4Изучение спектров отражения. 43

2.1.5Спектральный метод регистрации хода химической реакции в клетке. 43

2.2Спектральные методы анализа крови. 44

2.2.1Спектральные методы исследования производных гемоглобина. 44

2.2.2Спектральные исследования компонент крови. 47

2.2.3Спектральные методы анализа пятен крови. 50

2.2.4Литература по спектроскопии крови. 52

2.3Спектроскопия различных объектов. 55

2.3.1Спектроскопия тканей. 55

2.3.2Экспертиза волокон. 55

2.3.3Спектральные методы в экспертизе произведений искусств. 56

2.3.4Спектральные методы контроля качества пищевых продуктов. 57

2.3.5Спектральные методы контроля качества нефтепродуктов. 57

2.3.6Спектральные методы в минералогии. 57

2.3.7Спектральный анализ различных объектов. 58

2.4Литература по спектральным методам. 59

4

Глава 1. Микроскоп - спектрофотометр.

1.1 Спектральные методы контрастирования.

Спектральные методов находят все более широкое применение в микроскопии. Преимуществом спектральных методов является простота применения, оперативность, достоверность, высокая информативность. Большим преимуществом является возможность получения новых результатов путем небольшого дооснащения существующих микроскопов. Особо информативными являются методы получения и анализа мультиспектральных изображений - изображений исследуемых объектов в различных спектральных диапазонах. Регистрируются двумерные изображения в различных спектральных диапазонах. Одним из примеров такого подхода являются спектрозональные методы, которые применяются в космических исследованиях. Снимки Земной поверхности из космоса выполняют в различных спектральных диапазонах, и на основе этого получают информацию о свойствах Земной поверхности. Эта же методика применима и в микроскопии. В настоящее время появилась возможность применить спектральные методы в медицинской диагностике при исследовании препаратов с помощью микроскопа. Основная задача – повышение качества диагностики, и постепенные переход от субъективных и качественных методов диагностики к объективным и количественным методам диагностики.

Микроспектрофотометрия – один из разделов цитохимии, определение веществ с помощью микроскопа-спектрофотометра непосредственно в клетке по характерному спектру поглощения.

Человеческий глаз – уникальный оптический прибор, но для оценки состояния клеток на препаратах он обладает рядом существенных недостатков:

1-глаз формирует качественную оценку (приборы дают количественную оценку), 2-низкая чувствительность к изменению оптической плотности объекта, 3-объекты с разным спектром излучения воспринимаются как имеющие одинаковый цвет, 4-узкий спектральный диапазон чувствительности.

Микроскоп, как оптический прибор, формирует информацию о клетке в спектральном диапазоне от 200 до 1100 мкм. Человеческий глаз, как оптический прибор, регистрирует информацию в спектральном диапазоне от 400 до 700 мкм. Таким образом, получается, что микроскоп дает информацию, а человеческий глаз ее не видит.

Возникает вопрос - можно ли создать комплекс, который позволит получать количественную информацию о клетке в более широком спектральном диапазоне и с более высокой чувствительностью. И затем использовать эту дополнительную информацию для повышения качества диагностики.

Решением данного вопроса является комплекс, состоящий из микроскопа состыкованного со спектрофотометром. В этом случае приемником информации является не человеческий глаз, а спектрофотометр. Спектрофотометр дает количественную информацию о спектральных свойствах клетки, регистрирует более широкий спектральный диапазон излучения, обладает более высокой чувствительностью.

Спектральные диапазоны.

Условно используемый спектральный диапазон можно разделить на следующие области: 100-290 нм – (UV-C) УФ С – ультрафиолет короткие волны

290-320 нм – (UV-B) УФ В – ультрафиолет средние волны

320-400 нм – (UV-A) УФ А – ультрафиолет длинные волны

400-780 нм – видимый диапазон

780-1400 нм – (IR-A, Near-IR, NWIR) ближний инфракрасный (ИК) диапазон, 1400-3000 нм – (IR-B, Mid-IR, SWIR) средний инфракрасный (ИК) диапазон, 3000-10000 нм – (IR-C, Far-IR, MWIR) дальний инфракрасный (ИК) диапазон.

Наиболее часто рассматриваются ультрафиолетовый, видимый и инфракрасный диапазоны.

5

Можно выделить два основных типа приемников излучения для получения спектральной информации – точечные и двумерные.

-точечные приемники излучения (торец оптоволокна, ФЭУ, фотодиод) регистрируют излучение, исходящее из некоторой точки объекта.

-двумерные приемники регистрируют двумерное распределение излучения в плоскость объекта на определенной длине волны.

Можно выделить два типа установки устройств для выделения спектрального диапазона (светофильтры, перестраиваемый светофильтр, монохроматор):

-устройство устанавливается в блоке освещения. Объект освещается монохромным светом. -устройство устанавливается за объектом перед регистратором излучения. В этом случае в микроскопе используются обычные источники излучения.

Таблица 1-1. Возможные варианты конфигурации микроскопа-спектрофотометра.

1.2.1 Точечная регистрация. Монохроматическое освещение.

Регистрацию спектра можно производить с помощью фотодиода. При этом сканирование по длинам волн осуществляется с помощью монохроматора который освещает объект.

Рис. 1-1. Регистрация спектра с помощью фотодиода и освещение объекта с помощью монохроматора.

6

1977 – ГОИ – Ленинград

В ГОИ специалистами Агроскин Лев Семенович и его учеником Папаян Гарри Вазгенович в 1970 году были созданы двухволновой цитофотометр «Темп» и модуляционный микроспектрометр «Марш» для исследования спектров поглощения биологических объектов (клеток). Спектральный диапазон спектрометра 380-750 нм. Минимальный размер фотометрируемого участка 1 мкм. Время регистрации одного спектра 3 минуты. Они так же подготовили к промышленному выпуску прибор МЦФВ-1 и микроденситометр М-85.

Рис.1-2. Модуляционный микроспектрометр «Марш», разработанный в ГОИ, 1970 год.

Рис. 1-3. Оптическая схема модуляционный микроспектрометр «Марш». 1970 год. 1,2-осветитель, 3-7-монохроматор, 19-микрообъектив, 20-препарат, 21-конденсор, 24-ФЭУ, 38самописец.

7

1.2.2 Micro-spectroscope. Микроскоп с призменным спектроскопом.

В ранних работах по исследованию спектров микропрепаратов с помощью микроскопа использовали призменный щелевой спектроскоп. Спектроскоп изготовлялся в виде окулярной насадки. Спектр поглощения объекта можно видеть в окуляр в виде светлых и темных полос в поле зрения. Регистрация спектра осуществлялась путем зарисовки видимого спектра на бумаге, глядя в окуляр. Для привязки к длинам волн использовалась шкала микрометра.

Рис. 1-4. Микроспектроскопы различных фирма: 1 - R& J Beck, London, 2 - John Browning, London, 3 - Carl Zeiss, Jena

Рис. 1-5. Спектроскоп для микроскопа - Sorby-Browning Micro-Spectroscope, with Rack motion to Eye-piece, и его оптическая схема. 1865 год.

9