2 курс / Гистология / Спектральные_методы_в_микроскопии_Колтовой_Н_А_Краевой_С_А_

1865 – Sorby H.C. - Англия

Английский ученый Sorby Henry Clifton (1826-1908) с помощью микро-спектроскопа в 1865 году исследовал спектр поглощения высушенных пятен крови. Это необходимо для проведения судебно-медицинских экспертиз.

1865 - Sorby H.C. On the application of Spectrum-Analysis to Microscopical Investigations, and especially to the Detection of Blood Stains. The Quartely Lournal of Science. Volume II. Pp. 198-215. 1871 – H.C. Sorby F.R.S. On some Improvements in th e Spectrum Method of Detecting Blood. The Monthly Microdcopical Journal. Transaction of the Royal Microscopical Society. Volume 6, Issue 1, page 9-17. July 1871.

1871 – H.C. Sorby. Blood-Spectrum. Nature. 4. 505-5 05. 26 October 1871.

1871 - Sorby, H.C. On the Examination of Mixed Colouring Matters with the Spectrum Microscope. London: Robert Hardwicke, The Royal Microscopical Society, c.1871. 11 p.

1862 – Hoppe F. On the absorption Lines in the Bloo d Spectrum. Schmidt”s Jahrbuch d. ges. Med. cxiv. 1862.

1873 - W.T. Suffolk. F.R.M.S. Spectrum analysis as applied to microscopical observation. London. John Browning. 1873. 39 p.

Рис. 1-10. Спектр поглощения производных гемоглобина. 1-гемоглобин, 2-оксигемоглобин, 3- кабоксигемоглобин, 4-меттемоглобин.

В 1907 году Baker T.T. создал сравнительный спектроскоп для аналитической химии. Фирма Ziezz в 1930 году выпустила сравнительный спектроскоп. Спектроскоп позволял сравнивать спектры поглощения двух веществ. В окуляре видны одновременно спектры двух веществ один над другим.

12

1.2.3 Установка спектрофотометра на микроскопе.

1958 – Фирма ЛОМО – Санкт-Петербург - Россия

Первый в Советском Союзе промышленный прибор для спектрального исследования микрообъектов МУФ-4 был выпущен в 1958 году Государственным оптико-механическим заводам совметно с ГОИ. Кстановка представляет собой комплекс из ультрафиолетового микроскопа, спектральная аппаратура и система фотоэлектрического измерения световых потоков. Спектральный диапазон 250-700 нм. Диаметр фотометрируемого участка 1 мкм

Рис. 1-13. Микроспектрофотометрическая установка МУФ-5, 1960 год.

Фирмой ЛОМО (Санкт-Петербург) в настоящее время выпускается микроскопспектрофотометр МСФУ-К (на основе люминесцентного микроскопа Люмам РПО-11). http://www.lomo.ru – сайт фирмы ЛОМО.

Рис. 1-14. Микроскоп-спектрофотометр МСФУ-К фирмы ЛОМО, 2012 год.

14

Микроскоп может работать в проходящем и отраженном свете. Спектральный диапазон регистрации от 350 до 900 нм. В монохроматоре используется дифракционная решетка (600 линий на мм). Микроскоп имеет два источника излучения – галогеновая и ртутная лампы. Минимальный размер фотометрируемого участка – 1 мкм. С помощью монохроматора, который установлен на тринокуляре микроскопа, производится выделение интересующей области спектра. Регистрация спектра производится с помощью фотоумножителя. Получение спектра поглощения точечного объекта в поле зрения микроскопа производится путем механического сканирования дифракционной решетки в монохроматоре. Время регистрации спектра в одной точке занимает 3 минуты.

2012 – Фирма Craic Technologies - USA

Фирмой Craic Technologies разработана серия устройств для микроскопектрометрии. http://www.microspectra.com – сайт фирмы. Спектральный диапазон регистрации от 200 до 2100 нм. Регистрация спектра производится с помощью детектора в виде линейки чувствительных элементов. Поэтому нет необходимости производить механическое сканирование решеткой, и ввод всего спектра осуществляется за один такт.

Рис. 1-15. Микроспектроскоп фирмы CRAIC, установленный на микроскопе, 2012 год.

15

2012 – Фирма A.S.&Co. – Germany

Фирма A.S.&Co. разрабатывает модульные микроскопы спектрофотометры. Микроскопы-спектрофотометр можно скомплектовать из стандартных компонент под решаемую задачу. В качестве регистратора спектра на микроскоп устанавливается MMS (Monolithic Modular Spectrometer). Двумерный спектр формируется с помощью сканирования моторизованным столиком.

http://www.mikroskop-spektroskopie.de – сайт фирмы.

Рис. 1-19. Модульный принцип создания микроскопа-спектрофотометра.

18

1.2.4 Соединение микроскопа со спектрофотометром с помощью оптоволокна.

Рис. 1-20. Оптическая схема микроскопа-спектрофотометра.

Рис. 1-21. Стыковка микроскопа со спектрофотометром с помощью оптоволокна.

19

Микрокоп можно состыковать с любым спектрофотометром, у которого имеется оптоволоконный вход. Для микроскопа основным требованием является наличие тринокуляра (порт для подключения цифровой камеры), так как стыковка микроскопа со спектрофотометром осуществляется через тринокуляр. На самом деле, можно осуществить стыковку спектрофотометра с микроскопом и при отсутствии тринокуляра. В этом случае спектрофотометр стыкуется с микроскопом через переходник в один из окуляров.

При использовании микроскопов проходящего света можно регистрировать спектры поглощения клеток, зафиксированных на предметных стеклах. При использовании флуоресцентного микроскопа можно регистрировать спектры флуоресценции клеток. При использовании инвертированного микроскопа можно регистрировать спектры поглощения живых клеток в чашке Петри. При использовании стереомикроскопа можно регистрировать спектры отражения микрообъектов.

Стыковка микроскопа со спектрофотометром осуществляется с помощью оптического кабеля. Один конец оптического кабеля устанавливается на оптической оси микроскопа, а второй конец оптического кабеля подается на вход спектрофотометра.

Стыковка оптического кабеля с микроскопом осуществляется с помощью специального адаптера. С одной стороны адаптер имеет резьбу типа C-mount (резьба на видеокамерах) для соединения с тринокуляром микроскопа. С другой стороны адаптер имеет специальную оптическую резьбу для соединения с разъемом на оптическом кабеле. С помощью специального центрирующего приспособления можно точно отцентрировать положение оптического кабеля – чтобы он находился точно на оптической оси. Таким образом, оптический кабель устанавливается вместо цифровой камеры, и положение торца оптического кабеля юстируется таким образом, чтобы он находился на месте чувствительной матрицы цифровой камеры. Торец оптоволкна является чувствительным элементом, регистрирующим излучение.

Оценим размер области на препарате, с которой регистрируется спектр. Пусть используется объектив 10х. Это означает, сто увеличение микроскопа 10х. Если используется оптоволокно диаметром 200 мкм, значит при обратной проекции торца оптоволокна на предметную область получим пятно размером 20 мкм. Таким образом имеем следующее соответствие увеличения объектива и размера спектрофотометрируемой область: 4х – 50 мкм, 10х – 20 мкм, 20х10 мкм, 40х- 5 мкм, 100х – 2 мкм. При использовании оптоволокна большего или меньшего диаметра будем получать соответственно большее или меньшее значение размера области. Но необходимо отметить следующее – при уменьшении диаметра оптоволокна в два раза, в четыре раза уменьшится площадь торца, и соответственно в 4 раза уменьшится регистрируемый световой поток. Таким образом, минимальный размер регистрируемой области ограничивается чувствительностью спектрофотометра. Так же необходимо помнить, что при работе со слабыми световыми потоками резко возрастают шумы. Оптимальным диаметром оптоволокна можно считать 200 мкм.

Можно плавно менять размер регистрируемой области без смены объектива и оптоволокна. Для этого достаточно перемещать торец оптоволокна относительно отъюстированного положения. Таким образом, размер регистрируемой области может непрерывно изменяться от 2 мкм до 100 мкм.

При использовании стереомикроскопа, у которого имеется плавное изменение увеличения, размер регистрируемой области можно менять ориентировочно от 0,1 до 10 мм. Более точно границы рассчитываются на основе оптических характеристик конкретной модели микроскопа.

Изменяя размер регистрируемой области, можно получить обобщенный спектр целой группы клеток, или одной клетки. Для какой то отдельной клетки можно зарегистрировать спектр поглощения для ядра и для цитоплазмы отдельно.

Необходимо отметить, что не обязательно размер регистрируемой области должен соответствовать размеру изучаемого объекта. Размер регистрируемой области должен быть больше или равен размеру изучаемого объекта.

Допустим, что необходимо зарегистрировать спектр флуоресценции очень маленькой, и очень яркой частицы. Для этого нет необходимости использовать сверхтонкое оптоволокно. Для этого достаточно зарегистрировать спектр некоторого места на препарате, где нет частицы.

20