2 курс / Гистология / Спектральные_методы_в_микроскопии_Колтовой_Н_А_Краевой_С_А_
.pdfГлава 2. Применение спектральных методов.
2.1 Применение спектральных методов в медицине.
Спектральные методы исследования объектов широко применяются в медицине. Используются различные методики.
1 – Объект исследования (биожидкость, цельная кровь, плазма крови, сыворотка крови, клетки, биоптат, ткань на пациенте),
2- Исседуется собственные спектральные характеристики образца, или используется окрашивание образца различными красителями (оптическими или флуоресцентными),
3 – Спектральный диапазон исследования (УФ спектроскопия, спектроскопия в видимом диапазоне, ИК спектроскопия, КР-Рамановская спектроскопия, флуоресцентная спектроскопия),
4 – Цель исследования (мониторинг состояния пациента при проведении операции, диагносика различных заболеваний, диагностика рака).
Таблица 2-1. Методы спектроскопии.
Метод |
Кровь |
Ткань |
Хемилюминесценция |
|
|
УФ спектроскопия |
|
|
Спектроскопия в видимой области |
|
|
ИК спектроскопия |
|
|
КР спектроскопия |
|
|
Флуоресцентная спектроскопия |
|
|
|
|
|
2.1.1 Изучение спектров поглощения живых клеток в среде.
Если спектрофотометр подключить к инвертированному микроскопу, то можно проводить анализ спектральных характеристик живых клеток, находящихся в чашках Петри. Особо следует заметить, что при данном способе исследования клетки не подвергаются никакому дополнительному вредному воздействию. Для освещения клеток не используется никакой дополнительный источник освещения, а только галогеновая лампа, как и обычно. При изучении живых клеток регистрируется спектр поглощения излучения, прошедшего через клетку. В спектре поглощения живой клетки содержится информация о состоянии клетки, о процессах происходящих в клетке, о наличии различных веществ к составе клетки.
1-Первая задача состоит в выяснении вопроса – находится ли клетка в нормальном состоянии или нет. По спектру поглощения можно судить о том, что клетка находится в нормальном состоянии или она уже погибает. Такая задача исследовалась на ооцитах человека. Была получена информация о том, что спектры поглощения нормального ооцита и гибнущего ооцита существенно различались. Нужно ли говорить о том, что при наблюдении глазом в микроскоп это были две прозрачные клетки, практически не различимые.
2-Вторая задача при работе с живыми клетками состоит в выяснении вопроса о том, однородна даная колония клеток, или нет. В реальном масштабе времени идет сканирование калонии клеток на микроскопе и наблюдаются спектры поглощения. Если спектры клеток одинаковы – значит колония клеток однородная. Если имеются клетки с различными спектрами
– значит колония клеток неоднородная.
3-Третья задача – типирование клеток. Необходимо определить, какие типы клеток находятся в данной колонии. Для этого на этапе обучения на чистых культурах производится
41
формирование так называемых эталонных спектров для клеток различных типов. Затем при работе с культурой, регистрируют спектр исследуемой клетки и сравнивают его с ранее полученными спектрами. После этого принимается решение – относится ли клетка к одному из ранее изученных типов, или ее относят к нераспознанному типу. Интересный момент состоит в том, что довольно просто создать ручной сортер клеток. Для этого на инвертированный микроскоп устанавливают два простых микроманипулятора и на них устанавливают двойные держатели с микроинъекторами. Таким сортером возможно производить ручную сортировку клеток на четыре класса. После того, как клетка была идентифицирована и отнесена к одному из четырех классов, ее засасывают в соответствующий капилляр. Таким образом, через некоторое время, в четырех капиллярах сформируются четыре чистые культуры.
4-Четвертая задача – столовые клетки. Задача усложняется тем, что на начальном этапе не известно, является ли Даная клетка стволовой или нет. В этом случае эталонные спектры формируются другим путем.
Для выбранных клеток регистрируют спектры и смотрят как они развиваются. После того как прошел цикл развития, определяют какие клетки были правильными, а какие нет. После этого из спектров правильных клеток формирую эталонный спектр. Таким образом можно сделать вывод, что если клетка, которую мы пускаем в эксперимент имеет правильный спектр, то высока вероятность, что она будет развивать по правильному пути.
5-Количественное определение содержание отдельных компонент в клетке.
Например, заранее известен спектр поглощения гемоглобина. На основании этого можно определить содержание гемоглобина в отдельных эритроцитах (при этом имеется в виду, что эритроциты не окрашены, и работа производится с каплей свежей крови). Так как спектры оксигемоглобина и дезоксигемоглобина различаются, то возможно производить оценку содержания оксигемоглобина и дезоксигемоглобина отдельно.
2.1.2 Изучение спектров окрашенных клеток на предметном стекле.
При оценке степени окраски глазом имеет место быть высокая степень субъективизма, даже если человек не дальтоник. При регистрации степени окраски спектрофотометром мы получаем принципиально более достоверную информацию об окраске клеток. Вполне возможно, что клетки при апоптозе будут прокрашиваться немного по другому, но глаз не замечает этих различий.
2.1.3 Определение плоидности клеток.
С помощью комплекса можно получать количественную информацию о количестве красителя, которое поглотила заданная клетка. Например, если измерять количество красителя, которое поглотило ядро, то это сразу позволяет определять количество хроматина в ядре и определять плоидность клетки. Таким образом, можно выделять диплоидные и полиплоидные клетки. Как известно, наличие полиплоидных клеток является важным параметром для диагностики онкологических заболеваний.
1977 - Автандилов Г.Г. Василенко И.В. Бюлл. экспер.биол. 1977. т. 35. №7. с.54 -57. 1990 - Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. - М.: Медицина, 1990. - 384 с.
1998 - Автандилов Г.Г. Компьютерная микротелефотометрия в диагностической гистоцитопатологии. М. РМАПО, 1998. 256 с.
2000 - Автандилов Г.Г. Вопросы онкологии. 2000. т.46. №4. с.423 - 426.
2006 - Автандилов Г.Г. Диагностическая медицинская плоидометрия. М. Медицина. 2006. 192 с.
2010 – Омельянчук Л.В. Семешин В.Ф. Алексеева А.Л. Пальчикова И.Г. Жимулев И.Ф. (Новосибирск, Институт химической биологии и фундаментальной медицины) Интегральный метод измерения количества ДНК в клетке с использованием цифровой микрофотографии.
Цитология. 2010. т.52. №4. с.349-353.
42
2.1.4 Изучение спектров отражения.
Наряду с изучением спектров поглощения комплекс позволяет производить регистрацию и изучение спектров отражения. В этом случае используется внешний осветитель, который освещает объект сбоку, а отраженный спектр регистрируется через микроскоп. Данный метод применим при оценке биоптатов через микроскоп. Но особенно эффективен данный метод при диагностике заболеваний кожи. Для этого спектрофотометр соединяется со стереомикроскопом. Стереомикроскоп на выносной штанге устанавливается над исследуемым участком кожи человека и при большом увеличении оценивается состояние поверхности и подповерхностных слоев кожи. Анализ спектра позволяет судить о состоянии кровеносной системы. Возможно так же производить диагностику меланомы, так как меланин обладает особыми спектральными свойствами, и возможно производить измерение содержания меланина.
В ботанике очень информативным оказывается изучение спектров отражения от поверхности листа растения. Если имеется некоторое заболевание растения – то спектр отражения изменяется.
Спектр поглощения хлорофилла имеет два максимума – на длине волны 420 нм и 680 нм. Хлорофилл поглощает синий и красный свет. Зеленый свет не поглощается, поэтому листья – зеленые.
2.1.5 Спектральный метод регистрации хода химической реакции в клетке.
При стандартной методике регистрации спектра поглощения сигнал от нескольких молекул достаточно слаб. Новая методика состоит в том, что исследуемый объект (например, цитохом С) соединяется с наночастицами золота размером 20 нм. Под действием света частицы начинают колебаться (плазмотронный эффект). Частоты колебаний соответствуют длинам волн 530-580 нм. В этом случае сигнал на спектре поглощения гораздо более сильный, и можно зарегистрировать сотни и даже десятки молекул.
43
2.2 Спектральные методы анализа крови.
2.2.1 Спектральные методы исследования производных гемоглобина.
Гемоглобин – белок, содержащийся в эритроцитах, переносит кислород. Содержание производных гемоглобина в крови (350-650 нм) (670, 700 и 800 нм) -оксигемоглобин (HbO2) (415, 540 нм и 578 нм) /(541 и 577)/ (536-556 и 577-589) -дезоксигемоглобин (Hb) 431 и (554 нм)/ (543-596)
-карбоксигемоглобин (HbCO) (539 нм и 570 нм) (523-536 и 564-579) -метгемоглобин (MetHb)
Рис. 2-1. Спектр поглощения оксигемоглобина (1) и дезоксигемоглобина (2).
Рис. 2-2. Спектр поглощения оксигемоглобина (HbO2) и дезоксигемоглобина (Hb) в видимой области.
44
Рис. 2-3. Спектр поглощения производных гемоглобина: 1 – дезоксигемоглобина (HbH); 2 – карбоксигемоглобина (HbCO); 3 – оксигемоглобина (HbO2); 4 – метгемоглобина (MetHb).
Рис. 2-4. Спектры основных компонентов крови.
45
Рис. 2-5. Спектры поглощения оксигемоглобина и фетального гемоглобина.
Спектральные свойства оксигемоглобина характеризуются наличием двух полос поглощения в желто-зеленой части видимого спектра, одна из которых, лежащая ближе к красной области спектра, обозначается как а-полоса; другая, с более короткой длиной волны, более широкая и с менее резкими краями,- как полоса в. В фиолетовой части спектра лежит весьма интенсивная полоса поглощения, обозначаемая как г-полоса (или полоса Соре). Максимум а-полосы поглощения HbO2 находится в области длин волн 575-579 нм, максимум в- полосы приходится на 540-544 нм. г-полоса имеет максимум в интервале 410-416 нм. Между а-
ив-полосой находится минимум при 560 нм. а-, в- и г-полосы характерны для группы гема. Считается, что г-полоса обусловлена порфирином простетической группы.
Вближней инфракрасной области спектра оксигемоглобин имеет широкую малоинтенсивную полосу поглощения около 925 - 930 нм. В ультрафиолетовой области наблюдаются две полосы поглощения. г-полоса (343-360 нм) обусловлена связанным железом. Максимум ф-полосы, обусловленной белковой частью молекулы гемоглобина, находится при
275 - 280 нм.
Вместо а и в-полос в спектре поглощения деоксигемоглобина имеется одна, более широкая и менее интенсивная полоса в области 555-560 нм. Кривая поглощения асимметрична
иимеет отчетливый перегиб при 585-590 нм. В красной области спектра наблюдается слабая полоса с максимумом при 760 нм. Максимум широкой и интенсивной г-полосы находится на длине волны: 425 - 431 нм. В области 620-680 нм деоксигемоглобин поглощает свет во много раз сильнее, чем оксигемоглобин. В ближней инфракрасной области спектра деоксигемоглобин имеет полосу с максимумом при 910 нм.
Спектральные свойства метгемоглобина зависят от рН среды. При рН = 7 метгемоглобин находится в кислой форме. Спектр поглощения характеризуется узкой полосой с максимумом при 500 нм, широкой - в области 630 нм и интенсивной полосой Соре в интервале 405-407 нм. В области 540-570 нм имеются два перегиба кривой поглощения. При рН =7.4 (норма) 20% всего метгемоглобина составляет щелочной метгемоглобин. При увеличении рН спектр постепенно меняется: исчезает полоса с максимумом при 630 нм, заменяясь неотчетливым перегибом при 600 нм, в желто-зеленой области появляются две полосы поглощения с максимумами на 577 и 540 нм.
Максимум полосы Соре смещается к 411 нм. Щелочные растворы метгемоглобина имеют максимумы при 417, 540 и 578 нм, положение которых незначительно отличается от оксигемоглобиновых, но их интенсивность значительно ниже. После рН 9.4 увеличение рН приводит к исчезновению полос с максимумами при 577 нм и 540 нм.
46
2.2.2 Спектральные исследования компонент крови.
Спектры поглощения различных компонент крови.
220 нм - ацилгидроперекиси (продукты с изолированными двойными связями) – продукты перекисного окисления липидов, 232 нм - диеновые конъюгаты – продукты перекисного окисления липидов,
278 нм - кетодиены и сопряженне триены – продукты перекисного окисления липидов,
415 нм – |
оксигемоглобин, |
431 нм – |
дезоксигемоглобин, |
460 нм – |
билирубин, |
540 нм – |
оксигемоглобин, |
554 нм – |
дезоксигемоглобин, |
578 нм – |
оксигемоглобин, |
-гемохромоген – 554-565 нм
-гемопорфирин – 548-572 нм, 594-608 нм
2-Содержание кислорода в крови, пульсоксиметры
3-Коцентрация билирубина в плазме крови (максимум поглощения – 460 нм, контрольная длина волны – 550 нм)
4-содержание креатина в крови
5-скрининговые исследования содержания иммунокомпетентных клеток -нейтрофилы – 380-430 нм -лимфоциты – 460-580 нм -моноциты – 460-500 нм
47
Определение билирубина.
С помощью спектрального анализа можно определять содержание билирубина в крови. Билирубин – оранжево-желтый пигмент, содержится в крови, и имеет максимум в спектре поглощения на длине волны 460 нм. Определение билирубина в крови возможно производить неинвазивно, путем регистрации спектров отражения от кожи. Для повышения точности метода используют регистрацию отражения не на одной, а на двух длинах волн.
Рис. 2-6. Спектр поглощения плазмы крови при определении концентрации билирубина.
Фотометрирование можно проводить на спектрофотометрах на двух длинах волн 460 и 550 нм, на которых гемоглобин имеет одинаковые коэффициенты поглощения, а билирубин имеет максимум поглощения на длине волны 460 нм и не поглощает на длине волны 550 нм. Именно это позволяет исключить влияние гемоглобина при измерении концентрации билирубина.
Dплазма(460 нм) = DHb(460 нм)+ DBi(460 нм) Dплазма(550 нм) = DHb(550 нм)+ DBi(550 нм) DBi (460) = Dплазма(460 нм) - Dплазма(550 нм),
поскольку DBi(550 нм) = 0, а DHb(550 нм) = DHb(460 нм).
48
Рис. 2-7. Спектр поглощения прямого и непрямого билирубина.
Из всех компонент сыворотки крови в этом спектральном диапазоне особенно сильно поглощают свет гемоглобин (545нм и 575нм) и билирубин (460 нм).
Измеряя интенсивность поглощения сыворотки крови на длинах волн 545 нм и 575 нм можно определять степень гемолиза эритроцитов.
Билирубин представляет собой пигмент с ярко выраженной желтой окраской. Спектральная кривая поглощения имеет максимум на длине волны 460 нм. Измеряя поглощение на этой длине волны можно определить концентрацию общего билирубина в крови. Фирмой «Техномедика» (Москва) создан безреагентный микроанализатор общего билирубина крови у новорожденных «Билимет К». Прибор основан на методе двухволновой фотометрии. Измеряется поглощение крови на длинах волн 460нм и 550нм. (Б-билирубин, П-
плазма, Г-гемоглобин): П(460) = Г(460)+Б(460), П(550) = Г(550)+Б(550).
Так как Б(550 ) = 0, и Г(460) = Г(550), получаем, что Б(460) = П(460) - П(550). Для измерения необходимо 40 мкл крови. Измерение производится в тонком стеклянном капилляре.
Серийно выпускаются анализаторы билирубина фотометрические неонатальные АБФ01. Предназначены для измерения разности оптических плотностей анализируемой микродозы сыворотки крови на длинах волн 550 и 460 нм с последующим автоматическим пересчетом в концентрацию билирубина по заданному алгоритму, для применения в родильных домах, родильных отделениях, клиниках акушерства и центрах охраны здоровья матери и ребенка. Диапазон разности оптических плотностей от 0 до 0,6 Б. Погрешность от 0 до 0,2 Б ±0,02 Б; от
0,2 до 0,6 Б ±10%.
Определение содержания белка в плазме крови.
Одним из методов определения содержания белка является прямая спектрофотометрия (метод Вартбурга). Метод основан на способности ароматических аминокислот поглощать свет с длиной волны 280 нм. Интенсивность поглощения пропорциональна количеству белка.
В 1956 году Владимиров Ю.А. и Конев С.В. обнаружили явление флуоресценции белков плазмы крови. Таким образом, содержание белка можно определять флуоресцентным методом.
49
Определение количество кислорода в крови.
Кислород в крови переносится оксигемоглобином. Оксигемоглобин имеет фиксированные пики поглощения на длинах волн – 415 нм, 542 нм, 577 нм. Измеряя интенсивность поглощения на этих длинах волн можно определить количество кислорода в крови.
1959 – Крепс Е.М. Оксигемометрия. Техника, применение в физиологии и медицине. Л.
Медгиз. 1959. 222 с.
Определение концентрации нуклеиновых кислот.
Метод определения концентрации нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) в растворе основан на существовании у ДНК и РНК максимума поглощения при длине волны 260 нм. Это означает, что в растворах нуклеиновых кислот максимальная фотометрическая абсорбция наблюдается при 260 нм и прямо коррелирует с концентрацией ДНК или РНК. Другим показателем чистоты препарата ДНК или РНК является отношение значений поглощения 260нм/230нм. В случае чистого препарата это соотношение обычно равно 1.8 – 2.2. Меньшие значения коэффициента 260нм/230нм свидетельствуют о загрязнении препарата компонентами, которые остаются после процедуры выделения ДНК или РНК.
2.2.3 Спектральные методы анализа пятен крови.
1865 – Sorby H.C. - Англия
Английский ученый Sorby Henry Clifton (1826-1908) с помощью микро-спектроскопа в 1865 году исследовал спектр поглощения высушенных пятен крови. Это необходимо для проведения судебно-медицинских экспертиз.
1865 - Sorby H.C. On the application of Spectrum-Analysis to Microscopical Investigations, and especially to the Detection of Blood Stains. The Quartely Lournal of Science. Volume II. Pp. 198-215.
1871 – H.C. Sorby F.R.S. On some Improvements in th e Spectrum Method of Detecting Blood. The Monthly Microdcopical Journal. Transaction of the Royal Microscopical Society. Volume 6, Issue 1, page 9-17. July 1871.
1871 – H.C. Sorby. Blood-Spectrum. Nature. 4. 505-5 05. 26 October 1871.
1862 – Hoppe F. On the absorption Lines in the Bloo d Spectrum. Schmidt”s Jahrbuch d. ges. Med. cxiv. 1862.
1945 – Законов А.И.
1958 – Туманов А.К. Розанов А.А.
1960 – Одесса – Одесский медицинский институт – кафедра судебной медицины. Васильев Марлен Адольфовия – дмн, проф,
1957 - Васильев М.А. К вопросу об открытии минимальных количеств крови методом спектрографии в крайней фиолетовой области спектра. Материалы III Всесоюзного совещания судебно-медицинских экспертов и III Всесоюзной конференции научного общества судебных медиков и криминалистов. Рига, 1957, с.175-177.
1960 - Васильев М.А. О применении микроспектрографии при экспериментальном установлении минимальных количеств крови. Судебно-медицинская экспертиза. 1960. №2.
с.24-28.+ 1961 - Васильев М.А. Материалы к вопросу об экспертном установлении малых количеств
крови в пятнах. Диссертация кандидата медицинских наук. 1961.
50