2 курс / Гистология / Спектральные_методы_в_микроскопии_Колтовой_Н_А_Краевой_С_А_
.pdf
Использовать этот спектр как эталонный, и вычесть его из спектра препарата где имеется частица. Результирующий спектр и будет являться спектром исследуемой частицы. При таком методе можно работать с оптоволокном большого диаметра и высокой чувствительности.
Работа на данном комплексе осуществляется очень просто. Препарат, спектральные свойства которого необходимо измерить, устанавливают на оптической оси микроскопа. Для этой цели в окуляре имеется перекрестие, и клетку совмещают с этим перекрестием. Если объект находится на перекрестии – то это означает, что он находится на оптической оси микроскопа. На экране компьютера сразу отображается спектр данной клетки. Дело в том, что спектрофотометр подключен к компьютеру, и в реальном масштабе времени отображает спектр на экране монитора. При необходимости, полученный спектр можно сохранить и сравнить со спектрами других клеток.
1.3 Двумерная спектроскопия путем поточечного сканирования
При сканировании препарата с помощью перемещения столика по осям X и Y можно получить двумерную спектральную картину препарата. На самом деле полученный набор спектральных данных представляет собой трехмерную матрицу: X и Y - пространственные координаты на препарате, Z – длина волны поглощения, F(x,y,z) – величина поглощения.
1992 – фирма Applied Spectral Imaging – USA
Фирма Applied Spectral Imaging разработала специальный интерферометр Spectra View для получения мультиспектральных изображений. Интерферометр устанавливается на микроскоп. Спектральный диапазон 400-1000 нм. Спектральное разрешение 20 нм. Разрешение цифровой камеры 1360х1300 элементов. Время регистрации одного спектрального изображения 1 минута.
Рис. 1-22. Интерферометр фирмы Applied Spectral Imaging на микроскопе, 2012 год.
21
Рис. 1-23. Оптическая схема Фурье-интерферометра для получения мультиспектральных изображений.
С помощью Фурье-интерферометра формируется спектр пропускания объекта в одной точке объекта. Путем сканирования формируется двумерная картина спектрального состава излучения объекта.
1998 – Robert A. Buckwald, Dario Cabib, Yuval Garin i, Nir Katzir, Zvi Malik, Dirk G. Soeknsen. Spectral bio-imaging methods for biological research, medical diagnostics and therapy.
Patent US 5784162 A. 1998.+
2012 – Фирма Lightform Inc. – USA
Фирмой Lightform Inc. (USA) разработана спектральная система PARISS (Prism And Reflector Imaging Spectroscopy System).
www.lightforminc.com – сайт фирмы. В спектральной системе в качестве детектора излучения используется матрица детекторов. По одной координате происходит регистрация спектра, а по второй координате происходит регистрация спектра из различных точек препарата, расположенных на одной линии. Таким образом за один такт регистрируется спектр всех точек препарата на одной линии. Путем механического перемещения препарата по второй координате получается двумерный спектр препарата. Спектральный диапазо 360-800 нм.
22
Рис. 1-24. Оптическая схема спектральной системы PARISS.
Рис. 1-25. Спектральная система PARISS установленная на микроскопе со сканирующим столиком, 2012 год.
23
1.4 Двумерная спектроскопия.
Возможны два принципиально различных способа установки устройства для выделения интересующего спектрального диапазона (светофильтр, монохроматор) для получения мультиспектральных изображений:
1 - В блоке освещения. Установка между источником света и объектов. Формируется световой поток для освещения объекта с определенной длиной волны. Реализуется режим освещения объекта монохромным светом.
2 - В блоке регистрации. Установка между объектом и регистратором. Через объект походит весь световой поток, а затем из всего прошедшего светового потока выделяется свет определенной длины волны. Реализуется режим регистрации монохромного света.
1.4.1 Двумерная регистрация. Монохроматическое освещение.
Метод установки устройства для выделения спектрального диапазона (светофильтра, монохроматора) в блок освещения (освещение монохроматическим светом) имеет ряд принципиальных преимуществ:
1-Устранение флуоресценции. При освещении объекта широким спектром и при наличии в спектре синего или УФ компонент возможно возникновение флуоресценции объекта, которая исказит реальные спектральные характеристики.
2-Устранение рассеянного света. При освещении монохроматическим светом пропадает дополнительный рассеянный в объекте свет с другими длинами волн.
3-Более низкие требования к качеству объективов. При использовании монохроматического света возможно использование более дешевых объективов, в которых отсутствует корректировка на различные длины волн и отсутствует корректировка на хроматическую аберрацию, в которых не исправлена дисторсия. Если спектр регистрируется в точке на оптической оси, то возможно использование самых простых объективов, так как регистрируется только изображение точки на оптической оси. Только сферическая аберрация вносит вклад в размытие изображения точечного объекта.
4-Меньше нагревание объекта. При большой мощности источника освещения происходит меньшее нагревание объекта, так как на объект попадает не весь световой поток, а только небольшая часть потока.
Освещение объекта монохромным светом возможно различными способами:
1-Светодиоды. В настоящее время создано большое количество светодиодов с различными длинами волн в УФ, видимой и ИК области спектра. Светодиоды удобно использовать в связи с тем, что они формируют монохроматическое излучение и нет необходимости в использовании светофильтров или монохроматоров для выделения спектрального диапазона. Преимущества: доступность, небольшая стоимость, наличие светодиодов различных длин волн, наличие светодиодов большой мощности. Недостатки: спектр излучения светодиодов довольно широкий, наличие излучения с другими длинами волн.
2-Перестраиваемые лазеры. В последнее время появились лазеры с перестраиваемой длиной волны, что очень удобно для исследования спектральных свойств объектов. Преимущества: плавная перестройка длины волны излучения. Недостатки: высокая стоимость.
3-Светофильтры. Освещение источником света с широким спектром (галогеновая лампа) и выделение необходимого спектрального диапазона с помощью светофильтров. Преимущества: доступность, дешевизна, возможность заказать интерференционный светофильтр с необходимыми характеристиками. Недостатки: необходимо заранее знать необходимый диапазон, количество спектральных диапазонов ограничено количеством светофильтров, нет возможности плавно изменять диапазон.
24
При использовании узкополосных интерференционных светофильтров необходимо знать, спектральные что характеристики заказанного или приобретенного светофильтра справедливы только в случае, если свет падает перпендикулярно поверхности светофильтра. При отклонении угла падения света от 90 градусов, характеристики светофильтра изменяются. Максимум полосы пропускания сдвигается в более длинноволновую (красную) область. Это свойство можно использовать в мирных целях. Интерференционный светофильтр можно использовать как перестраиваемый светофильтр за счет регулировки угла поворота относительно падающего света.
Рис. 1-26. Револьверный моторизованный набор переключаемых светофильтров, выпускаемый фирмой Prior Scientific.
Рис. 1-27. Линейный держатель фильтров.
Выпускается «Набор цветного оптического стекла» состоящий из 98 светофильтров из цветного стекла размером 40х40 мм, и 80х80 мм. К набору прикладывается книга с полными спектрами – показатели поглощения (оптическая плотность) и спектральная кривая коэффициента пропускания для всех светофильтров в виде таблиц и в виде графиков в области от 280 до 3000 нм.
-Каталог цветного стекла. Издательство «Машиностроение» Москва, 1967. 62 с.
Рис. 1-28. Набор цветного оптического стекла.
25
4- Светофильтры с переменным коэффициентом пропускания.
В природе существуют светофильтры в виде полоски с переменной длиной волны пропускания. Цвет светофильтра плавно изменяется от синего до красного при смещении вдоль полоски от одного края к другому. Такой светофильтр можно использовать как перестраиваемый светофильтр.
Известен светофильтр переменной плотности (graduated color filter), состоящий из пластины оптического материала с поверхностным слоем, имеющим переменный коэффициент пропускания или отражения вдоль одной из координат. Поверхностный слой создается, как правило, путем напыления на прозрачную подложку из оптического материала поглощающего слоя (обычно - хрома) переменной толщины. Изменение толщины слоя по координате x обеспечивает плавную регулировку оптического излучения.
1990 - Melles Griot. Optics Guide 5. Каталог продуктов производимых фирмой Melles Griot, Germany D-6100, Darmstadt, 1990, стр. 11-23.
2002 – Xu XX1, Lin HB, Yu G, Zhu J, Zhang CZ, Zhang GY. (China, Nankai University) Research of image spectrometer using linear variable interference filter. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 2002 Oct;22(5):713-7.
2004 - Michael Gouzman, Nadia Lifshitz, Excitation– emission fluorimeter based on linear interference filters. Applied Optics. Vol.43. No.15. 20 may 2004. p.3066-3072.+
В работе описывается применение линейных интерференционных фильтров (LIF – linear interference filters) для регстрации спектров.
Линейные интерференционные фильтры выпускаются фирмой Schott и поставляются фирмой Edmund Optics, Barrington, New Jersey. Выпускается два типа фильтров для видимого диапазона (400-700 нм) и для ИК диапазона (400-1000 нм). Выпускается два типоразмера фильтров 2,5х6 см, и 2,5х20 см.
2014 – Henrik Fabricius and Oliver Pust (DELTA Opti cal Thin Film) Linear Variable Filters for Applications in Spectroscopy and Fluorescence Diagnostics.
Фирма Delta Optical выпускает линейные фильтры с спектральным диапазоном 350-850
нм.
Рис. 1-29. Спектральная характеристика линейного фильтра.
Рис. 1-30. Линейный фильтр.
26
5-Монохроматор. Освещение источником света с широким спектром (галогеновая лампа) и выделение необходимого спектрального диапазона с помощью монохроматора. Преимуществом монохроматора является возможность плавно изменять спектральный диапазон. Недостатки: высокая стоимость. Возможны два типа монохроматоров – на основе дифракционной решетки и на основе призмы.
Рис. 1-31. Микроскоп-спектрофотометр HIRIM фирмы KAIROS Scientific Inc. (USA).
6-Перестраиваемый акусто-оптический фильтр.
Выпускаются перестраиваемые акусто-оптические фильтры (AOTF – acusto-optica tunable filter).
7-Специальный перестраиваемый источник света.
Фирмой CRI (USA) разработана спектральная система Nuance Multispectral Imaging Systems на основе специального перестраиваемого источника света на основе жидкокристаллического перестраиваемого фильтра VariSpec (LCTF - Liquid Crystal Tunable Filter). В конструкции фильтра отсутствуют движущиеся части. Регистрация выделенного спектрального диапазона осуществляется с помощью монохромной камеры. Возможна работа в двух спектральных диапазонах VIS - 420-720 или NIR - 850-1800 нм. Ширина выделяемого спектрального диапазона от 7 до 20 нм.
Рис. 1-32. Специальный перестраиваемый источник света VariSpec, 2012 год.
27
Рис. 1-33. Спектральная система Nuance, 2012 год.
Регистрация. При освещении объекта монохромным светом регистрация монохромного изображения препарата осуществляется с помощью монохромной камеры.
Важным случаем спектрального анализа является случай, когда регистрируются двумерные изображения объектов в различных спектральных диапазонах. Одним из примеров такого подхода являются спектрозональные методы, которые применяются в космических исследованиях. Снимки Земной поверхности из космоса выполняют в различных спектральных диапазонах, и на основе этого получают информацию о свойствах Земной поверхности.
Преимуществом двумерного спектрального анализа является то, что мы получаем спектральную информацию сразу о всех объектах, находящихся в поле зрения. Недостатком данного метода (кроме дороговизны аппаратуры) является то, что от всей спектральной информации используется, как правило, только несколько компонент. Обычно на первом этапе с помощью точечного спектроанализатора выявляется спектральный диапазон, в котором находится информация об интересующем нас объекте. Затем с помощью двумерного спектроанализатора выявляются сразу все объекты, которые поглощают в данном спектральном диапазоне.
1.4.2 Двумерная регистрация. Обычное освещение.
Возможны различные методы регистрации мультиспектральных изображений при освещении объекта источником света с широким спектром излучения.
1 - Цветная цифровая камера. Самым простым методом двумерного спектрального анализа является регистрация изображения с микроскопа с помощью цветной цифровой камеры. В ПЗС матрице цветной камеры все чувствительные элементы разбиты на три группы, которые покрыты красным, зеленым и синим светофильтрами соответственно. Таким образом, камера регистрирует сразу три спектральных диапазона: синий, зеленый и красный.
28
Рис. 1-34. Спектральная чувствительность цветной CCD камеры.
2 - Светофильтры. Светофильтры устанавливаются перед цифровой камерой. В этом случае желательно использовать черно-белую камеру. Черно-белые камеры обладают более высокой чувствительностью. Иногда устанавливается специальный крутящийся барабан с установленными светофильтрами, что облегчает смену светофильтров.
Фирма Pixelteq (Netherlands) создала специальную цифровую камеру со встроенными светофильтрами для регистрации мультиспектральных изображений. Камера имеет 8 встроенных светофильтров. Камера имеет разрешение 1392х1040 элементов. Камера позволяет регистрировать изображения в видимом и ближнем ИК диапазонах.
http://www.pixelteq.com – сайт фирмы.
Рис. 1-35. Цифровая камера Spectrocam фирмы Pixelteq, 2012 год.
29
Рис. 1-36. Спектральная чувствительность камеры Spectrocam.
Рис. 1-37. Черно-белая камера с револьверным переключением светофильтров. -Gordon Couger. Roll your own microscope. Micscape Magazine. December 2002.
30