2 курс / Гистология / Спектральные_методы_в_микроскопии_Колтовой_Н_А_Краевой_С_А_

-Levin, Ira W.; Lewis, Edgar N.; Treado, Patrick J.

Spectroscopic imaging device employing imaging quality spectral filters. Patent 5528368, МКИ6 G 01 B 9/02,- 363363; Заявл. 19941223; Опубл. 19960618; НКИ 356/346.

Предложено несколько вариантов принципиальных оптико-электронных схем микроскопов, предназначенных для получения спектральных изображений объектов в дискретных значениях длин волн в УФ, видимой, близкой ИК и ИК областях спектра со спектральным разрешением 0,01-1 нм. Микроскоп содержит три приемника: матричный, видеокамеру и точечный. Основным элементом его является быстроперестраиваемый акустооптический фильтр, работой которого управляет ЭВМ. Перестройка фильтра с одной длины волны на другую осуществляется за 5 мкс. Фильтр расположен непосредственно после источника света, в качестве которого используется ртутная лампа высокого давления. Микроскоп может работать в отраженном и проходящем свете.

-Michael D. Schaeberle ; John F. Turner II and Patrick J. Treado

"Multiplexed acousto-optic tunable filter (AOTF) spectral imaging microscopy", Proc. SPIE 2173, Image Acquisition and Scientific Imaging Systems, 11 (May 5, 1994); doi:10.1117/12.175166

- Wachman E.S, Niu W, Farkas D.L.

AOTF microscope for imaging with increased speed and spectral versatility. Biophys J. 1997 Sep;73(3):1215-22.

4 - Перестраиваемый жидкористаллический светофильтр

(Liquid Crystal Tunable Filters)

Новой разработкой является перестраиваемый жидкокристаллический фильтр VariSpec

разработанный фирмой PerkinElmer. -http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/varispc –

сайт. Разработано несколько различных вариантов фильтра для различных спектральных диапазонов 400-720 нм, 650-1100 нм, 850-1800 нм, 1200-2450 нм. Апертура фильтров – 35 мм.

Фильтры управляются от компьютера через интерфейс USB.

Рис. 1-41. Перестраиваемый жидкокристаллический светофильтр фирмы PerkinElmer, 2014.

33

1.5 Оптимизация получения спектральных данных.

Регистрируемое значение спектра поглощения объекта является произведением трех функций: F0(l)=F1(l)xF2(l)xF3(l)xF4(l), где

F1(l) – спектр источника излучения, F2(l) – спектр поглощения объекта,

F3(l) – спектральная чувствительность детектора излучения, F4(l) – спектральная эффективность дифракционной решетки.

Максимальное значение F0(l) не должно превышать максимальное допустимое значение для величины регистрируемого детектором сигнала. Подстройка уровня сигнала производится двумя способами – регулировкой источника и/или детектора.

Источник. Если источником света является галогеновая лампа, то интенсивность свечения лампы можно регулировать путем изменения напряжения на лампе. При этом необходимо учитывать, что при уменьшении напряжения на лампе максимум спектра излучения сдвигается в более длинноволновую область. При использовании в качестве источника света ртутной лампы интенсивность света не регулируется с помощью напряжения. Можно уменьшить интенсивность света с помощью нейтральных светофильтров. Имеются стеклянные нейтральные светофильтры с различным коэффициентом пропускания. В качестве нейтрального светофильтра с переменным коэффициентом пропускания можно использовать два поляризационных фильтра. В зависимости от угла между поляроидами коэффициент пропускания изменяется. Недостатком стеклянных светофильтров является их спектральная неоднородность. Почти идеальным нейтральным светофильтром с постоянным коэффициентом пропускания практически во всем спектральном диапазоне является металлическая сетка. Изменяя количество сеток и шаг сетки можно получить нейтральные светофильтры различной плотности.

В любом случае желательно получать максимально возможный поток излучения, но не такой сильный, чтобы он вызвал разрушение объекта исследования. Обычно разрушение объекта происходит из-за нагревания объекта, вызванного поглощением света. Иногда удобно использовать очень мощные импульсные источники излучения. За счет малой длительности импульса не происходит сильного нагрева объекта при высокой мощности излучения.

Детектор. Иногда можно регулировать чувствительность детектора. Если сигнал слабый, то иногда можно переходить в режим накопления сигнала.

Концентрация анализируемого вещества.

При анализе спектров поглощения сыворотки крови в широком спектральном диапазоне возникают определенные трудности. Величина поглощения существенно различается в различных диапазонах. В области УФ очень сильно поглощают белки, и сыворотка практически не прозрачна в области УФ. В видимой области, наоборот, поглощения очень слабое. В связи с этим необходимо проводить регистрацию спектра дважды. Для регистрации поглощения белков в области УФ необходимо разводить сыворотку в отношении 1:100000. Для регистрации поглощения в видимой области можно использовать не разведенную сыворотку. Наоборот, для увеличения сигнала (величины поглощения) можно проводить изерения в кюветах с большим оптическим путем 20-60 мм.

Метод расширения динамического диапазона регистрируемого сигнала – Двойное сканирование. Сложным случаем регистрации спектральных данных является случай, когда на регистрируемом спектре присутствуют два типа пиков – высокоинтенсивные пики фоновых компонент и низкоинтенсивные пики для исследуемых компонент. В этом случае необходимо проводит двухэтапную регистрацию спектров. На первом этапе с малым усилением регистрируются высокоинтенсивные пики. На втором этапе с большим усилением регистрируются низкоинтенсивные пики.

34

Эта операция называется расширение динамического диапазона. Дело в том, что при регистрации высокоинтенсивных пиков с малым усилением малые пики могут либо совсем не проявиться, либо проявиться с очень слабой структурой. И с помощью математического масштабирования мы не сможем получить информации о структуре малых пиков.

Регистрация спектров с большим усилением происходит при максимальной интенсивности источника света, максимальном раскрытии щелей в освещающем и регистрирующим монохроматоре. При этом будет происходить пересвет в области больших пиков, но зато проявится тонкая структура малых пиков. Возможны два варианта. Если детектору не страшен пересвет, то можно сканировать весь диапазон, если детектор может быть поврежден большим потоком, то сканирование производится только в том спектральном диапазоне, где нет больших пиков. Эти поддиапазоны определяются на первом этапе регистрации спектра.

При регистрации изображений существует метод расширения динамического диапазона (HDRI – High dynamic range image). Для расширения динамического диапазона изображений делается несколько снимков с различным временем экспозиции (брекетинг по экспозиции с шагом в 2 ступени). Синтез итогового изображения можно произвести средствами программы

Photoshop.

2005 - Жувикин Г.В. Иванов В.А. Система регистрации светового излучения в большом динамическом диапазоне. Патент 2250441. 2005. Изобретение относится к контрольноизмерительной технике и может быть использовано в системах регистрации оптического излучения с большим динамическим диапазоном. Изобретение основано на преобразовании сигнала заряда, кратного заряду однофотонного импульса, в напряжение, хранении результата в аналоговой форме в блоке предварительной обработки сигнала независимо от величины регистрируемого сигнала, многократном и циклическом повторении вышеуказанных операций с последующим суммированием результатов, при этом выбирается масштаб шкалы аналогоцифрового преобразования (АЦП) в соответствии со статистическими характеристиками ФЭУ и АЦП. Для сокращения избыточности передачи информации выбирается АЦП с неравномерной шкалой шага квантования.

Оптимальная конфигурация оптической системы для регистрации спектральных данных. Возможны два принципиально различных способа установки монохроматора при регистрации спектра:

1 - В блоке освещения. Монохроматор устанавливается между источником света и объектов. Формируется световой поток для освещения объекта с определенной длиной волны. Реализуется режим освещения объекта монохромным светом.

2 - В блоке регистрации. Монохроматор устанавливается между объектом и регистратором. Через объект походит весь световой поток, а затем из всего прошедшего светового потока выделяется свет определенной длины волны. Реализуется режим регистрации монохромного света.

Для простых веществ обе оптические схемы проводят к одинаковому спектру. Если в исследуемом многокомпонентном растворе содержатся флуоресцирующие вещества, то в результате применения разных оптических схем зарегистрируются различные спектры.

Если монохроматор расположен после источники, и объект освещается монохроматическим светом, то регистрируется истинный спектр поглощения.

Если монохроматор расположен после объекта перед детектором, то объект освещается светом в широком спектральном диапазоне. Предположим, что в растворе существует компонент, который флуоресцирует в красной области спектра. Тогда при регистрации спектра поглощения в красное области спектра будет отрицательное поглощение. Это означает, что из объекта вылетело больше красных фотонов, чем влетело. Это происходит из-за перераспределения фотонов в образце. Часть фотонов с большой энергией (УФ) поглотилось, а вместо них вылетели фотоны с малой энергией (красные).

35

1.6 Обработка мультиспектральных данных.

Для обработки мультиспектральных изображений необходимо специальное программное обеспечение, и, что еще более важно, необходимы специальные методы обработки мультиспектральных изображений. Ранее такие методы применялись при обработке мультиспектральных космических снимков. Промоделировать обработку мультиспектральных данных можно с помощью программы Photoshop. Каждое цветное изображение состоит из трех монохромных изображений (каналов) – красный, зеленый, синий. При обработке изображений операции применяются одновременно ко всем трем каналам. Но с помощью функции Изображение – Регулировка – Уровни можно корректировать каждый канал независимо. Отдельно каналы можно просмотреть с помощью функции Окно – Каналы. Можно каждый канал скопировать в отдельное изображение и обрабатывать независимо от других каналов.

Один из методов обработки состоит в вычисления разности между изображениями, полученными в различных спектральных диапазонах. В программе Photoshop получить разностное изображение между каналами можно с помощью функции Изображение – Вычисления.

1.6.1 Задача сегментации многозональных изображений.

Одной из важных задач обработки мультиспектральных данных является задача сегментации (выделения объекта). Для сегментации необходимо сформировать критерий близости для двух точек изображения. Если мера близости меньше некоторого порога, то данные точки изображения относятся к одному объекту. F(x,y,L) – это интенсивность элемента изображения, расположенного в строке X и столбце Y и зарегистрированного на длине волны L.

Рис. 1-42. Структура мультиспектрального изображения.

При обработке спектральных флуоресцентных изображений обычно задача сегментации решается достаточно просто. Для получения цветного флуоресцентного изображения исходный препарат окрашивают небольшим количеством красителей (обычно не более трех). Красители выбираются так, чтобы их спектры флуоресценции сильно различались. Тогда в результирующем изображении автоматически выделяются области, окрашенные различными красителями. Число областей равно числу красителей. Иногда возникают некоторые сложности, когда в некоторой области клетки поглощается несколько различных красителей. В этом случае возникают дополнительные цвета на флуоресцентном изображениии (но не дополнительные максимумы в мультиспектральном изображении.

При регистрации мультиспектральных изображений неокрашенных препаратов структура спектров в каждой точке имеет сложный характер, и отражает соотношение

36

большого количества компонент. В этом случае сегментацию мультиспектральных изображений проводить гораздо сложнее.

Рассмотрим некоторые алгоритмы сегментации:

1 -Близость по одному изображению: Mod(F(x,y,l0)-F(x0,y0,l0))<c

2 -Близость по спектральным изображениям: Summ(L)(F(x,y,L)-F(x0,y0,L))<c

3 -Пороговый по одному изображению: F(x,y,l0)>c

4 - Пороговый по одному изображению: (Max(L)F(x,y,l))>c

5 - Пороговый по одному изображению: (Min(L)F(x,y,l))>c

6 - Пороговый по одному изображению: (Summ(L)F(x,y,l))>c

7 - Пороговый по двум изображениям: Mod(F(x,y,l1)-F(x,y,l2))>c 8 - Пороговый по двум изображениям: (F(x,y,l1)+F(x,y,l2))>c

9 - Пороговый по двум изображениям: Max(F(x,y,l1),F(x,y,l2))>c

10Пороговый по двум изображениям: Min(F(x,y,l1),F(x,y,l2))>c

11Пороговый по трем изображениям: (F(x,y,l1)+F(x,y,l2)+F(x,y,l3))>c

12Пороговый по трем изображениям: Max(F(x,y,l1),F(x,y,l2),F(x,y,l3))>c

13Пороговый по четырем изображениям: (F(x,y,l1)+F(x,y,l2)+F(x,y,l3)+F(x,y,l4))>c

14Пороговый по четырем изображениям: Max(F(x,y,l1),F(x,y,l2),F(x,y,l3),F(x,y,l4))>c

15Пороговый по двум изображениям: ((F(x,y,l1)-F(x0,y0,l1))- (F(x,y,l2)-F(x0,y0,l2)))>c

Для выбора параметров L0, L1, L2, L3 – существуют специальные алгоритмы.

Сегментация на основе спектрального максимума. Пусть имеется мультиспектральное изображение – несколько снимков, полученных в различных спектральных диапазонах. Рассмотрим некоторую точку на изображении. Проанализируем значение интенсивности этой точки на различных снимках. Присвоим этой точке значение номера спектрального снимка, на котором значение интенсивности точки было максимально. Проделаем эту операцию со всеми точками на изображении. В результате получим сегментированное изображение. Точки изображения, которые имеют максимум на одном и том же спектральном снимке получат одинаковые номера. Значит, точки с похожими спектральными характеристиками будут иметь одинаковый номер. Очевидно, что число типов точек (число сегментов) не будет превышать число спектральных диапазонов. Данная модель сегментации хорошо работает в случае, когда на мультиспектральном изображении имеется несколько различных областей (компонент), у каждой из которых свой максимум поглощения.

Рассмотрим модель, когда необходимо произвести сегментацию мультиспектрального изображения по соотношению двух компонент. Выбираем два спектральных диапазона, соответствующих этим компонентам. Строим разностное изображение, и преобразует его в черно-белое изображение. В светлых областях преобладает первый компонент, в темных областях преобладает второй компонент.

37

1.6.2 Выделение границы на многозональном изображении.

Можно привести несколько определений границы на многозональном изображении. В каждой точке компонентного изображения вычисляется перепад яркости – разность между значениями яркости в соседних точках.

1-На основе всех компонент многозонального изображения строится яркостное изображение. В яркостном изображении яркость каждой точки равна сумме яркостей всех изображений. Если в некоторой точке перепад яркости больше порога – то это граничная точка.

2-Каждый компонент многозонального изображения анализируется отдельно. Точка считается граничной, если перепад яркость в этой точке больше порога. В результирующем изображении точка считается граничной, если она является граничной хотя бы для одной компоненты.

3-Каждый компонент многозонального изображения анализируется отдельно. Точка считается граничной, если перепад яркость в этой точке больше порога. В результирующем изображении точка считается граничной, если она является граничной во всех компонентах.

4-Каждому элементу на многозональном изображении соответствует некоторая точка в многомерном признаковом пространстве. Значение признака Ni равняется значению яркости на компоненте i многозонального изображения. В данном многомерном пространстве вводится некоторая метрика. Некоторая точка на многозональном изображении является граничной, если расстояние до соседней точки больше порога. Например, для каждой точки перепад яркости вычисляется как корень квадратный из суммы квадратов перепадов яркости отдельных компонент. Если в некоторой точке перепад яркости больше порога – то это граничная точка.

38

1.6.3 Распознавание объектов по спектральным данным.

На первом этапе формируются так называемые эталонные спектры для каждого класса объектов. Один из методов формирования эталонного спектра состоит в том, что вводится несколько десятков спектров объектов заданного класса, и полученные спектры усредняются. После того, как сформированы эталоны, можно решать задачу идентификации микрообъектов. Для этого вводится метрика в пространстве спектров. При предъявлении неизвестного объекта он относится к тому класса, расстояние до спектра которого минимально. Таким образом, имеется возможность осуществлять поиск аналогичных образцов по составленной заранее базе данных эталонных спектров. Существуют и другие способы интерпретации спектров:

1-Распознавание по одной длине волны. Пусть заранее известно, что некоторое вещество поглощает излучение на определенной длине волны. Необходимо определить, имеется ли в поле зрения это вещество. Для этого достаточно по спектру определить, имеется ли на этой длине волны пик поглощения.

2-Распознавание по двум длинам волн. Измеряется отношение величин поглощения в спектре для двух фиксированных значений длин волн. В зависимости от величины этого отношения принимается решение об отнесении исследуемого объекта к одному из классов.

Этот метод применяется при экспертизе твердых жиров. Измеряется коэффициент отражения для следующих длин волн – 410 нм и 510нм.

3-Распознавание по трем длинам волн. Из всего спектра выбираются и сравниваются коэффициенты поглощения только для трех длин волн. Для этого спектральные данные отображаются в двухмерном признаковом пространстве. Пространство признаков двухмерно, так как три значения нормируются так, чтобы в сумме давать единицу. Другой вариант состоит в анализе двух отношений: отношения первых двух величин к третьей. Этот метод аналогичен трехкомпонентному представлению цветового зрения. Однако в этом случае в качестве базовых используются не красный (700нм), зеленый (500нм) и синий (400нм) длины волн, а наиболее информативные для распознавания длины волн. Это псевдоцвет. Но полученные данные так же можно отображать в псевдоцветах на экране монитора. Данный метод применяется для экспертизы мясной продукции. В этом случае измеряется коэффициент поглощения на следующих длинах волн – 545 нм, 582нм, 650нм.

4-Распознавание по четырем длинам волн. Если для идентификации объектов не хватает информации, получаемой по трем длинам волн, то производится более тонкий анализ на основе коэффициентов поглощения для четырех длин волн.

Наращивание мощность метода можно проводить и дальше, увеличивая количество анализируемых длин волн. Важная задача состоит в том, как выбрать наиболее информативные длины волн, по которым происходит распознавание. Для этого существует специальная методика.

39

1.6.4 Программы для обработки мультиспектральных данных.

2013 – Фирма LIM – Laboratory Imaging Ltd. – Прага – Чехия

Фирмой LIM (Чехия) разработано универсальное программное обеспечение LUCIA для обработки изображений. Имеется специальная версия программы для обработки мультиспктральных изображений – LICIA SpectralSystem for Microspectrometry and colorimetry.

http://www.lim.cz – сайт компании.

Рис. 1-43. Комплекс для спектральных исследований.

Рис. 1-44. Программа обработки мультиспектральных изображений.

40