значения каждого сигнала, их отношение и изменение во времени. Диски выполнены сменными, каждый из них содержит определенную комбинацию светофильтров, предназначенную для решения разных задач. В разработанном приборе соответствующим образом расположенные пары светофильтров позволяют измерять три-четыре полосы флуоресценции при их оптимальном возбуждении.

В приборе предусмотрена возможность работы с контактной оптикой, что позволяет проводить прижизненные исследования на целых органах животных. Для фокусировки на различную глубину органа тубусная линза 15 (см. рис. 2.5) заменяется оптической системой 21, состоящей из неподвижной отрицательной и перемещаемой вдоль оптической оси положительной линзы. Наблюдение объекта осуществляется в этом случае в свете флуоресценции или по методу темного поля в падающем свете.

Раздельное возбуждение с возможностью выбора оптимальных для каждого вещества условий и раздельная же регистрация их люминесценции с последующей автоматической обработкой результатов являются, несомненно, одним из важнейших преимуществ описанного микрофлуориметра. Следует при этом иметь в виду, что использование раздельного возбуждения меняет величины регистрируемых отношений полос люминесценции. В частности, при исследовании препарата рецептора растяжения рака (см. табл. 3) с применением данного микрофлуориметра для клеток разного типа были получены отношения интенсивности люминесценции окисленных флавопротеинов к таковой восстановленных пиридиннуклеотидов ξ1, примерно в 2 раза более высокие, чем аналогичные отношения ξ, измеряемые при суммарном возбуждении обоих компонентов окислительного обмена излучением с длиной волны 365 им:

Это и следовало ожидать из сопоставления спектров поглощения окисленных флавопротеинов с длиной волны возбуждения.

Заканчивая рассмотрение различных систем микроспектрального анализа одиночных клеток, необходимо отметить, что в последнее время в ЛОМО разработана и выпущена специальная микроспектральная насадка СФН-10, которая в комплекте с микроскопом МЛ-4 или «Люмам-ИЗ», а также с соответствующими электронными блоками измерения и регистрации представляет собой микроспектрофлуориметр для области спектра от 300 до 800 нм.

Приложение 3

П3. Приборы и методы автоматического анализа клеточных популяций

В заключение следует хотя бы кратко остановиться на методах автоматического анализа одиночных клеток с целью получения статистически усредненной информации о популяции этих клеток [397-406]. Задача измерения параметров большого количества одиночных клеток и последующего построения соответствующих гистограмм приводит к необходимости упрощения способа регистрации спектральных характеристик клеток. В этом случае микроспектрофлуориметр заменяется одним из описанных выше многоканальных микрофлуориметров и измеряются интенсивности люминесценции одной и той же клетки в нескольких, выбранных в соответствии с характеристиками красителей длинах волн. Специальные вычислительные устройства используют эти данные для построения гистограмм, характеризующих популяцию клеток в целом.

Естественно, что при этом автоматизации подлежит и процесс предъявления клеток анализирующему устройству, что достигается применением сканирующего столика или проточной системы и специальной камеры для образца (рис. 3.1), в которой окрашенные клетки (1) потоком жидкости подаются по капилляру (2) и через зазор между калиброванным концом капилляра и покровным стеклом камеры (3) выносятся из измерительной камеры 5. Зазор между концом капилляра и покровным стеклом находится в фокусе микрообъектива многоканального микрофлуориметра. Поэтому в момент прохождения клетки через зазор возникает импульсный световой сигнал определенного спектрального состава. Оптическая система разделяет

монохроматические составляющие этого сигнала и направляет их в соответствующие каналы регистрации. Автоматические устройства выдают гистограммы сигналов либо для каждого из каналов регистрации, либо для отношения их.

Рис. 3.1. Проточная камера для автоматического многоканального анализа клеточных популяций.

1 – флуорохромированные клетки;

2– калиброванный капилляр;

3– покровное стекло камеры;

4– микрообъектив многоканального микрофлуориметра;

5– корпус камеры.

Одним из примеров использования такого метода может служить определение ДНК, белка и объема одиночных клеток из больших популяций с применением двойной окраски [397]. Суспензия фиксированных клеток предварительно обрабатывалась РНКазой и затем окрашивалась для определения ДНК раствором пропидиум иодида (0,05 мг/мл в 2%-ном цитрате натрия), одного из аналогов этидиум бромида [404]. После промывки эти клетки окрашивались дополнительно флуоресценизотиоцианатом (ФИТЦ) для выявления белка.

Спектры люминесценции обработанных таким образом клеток имеют максимумы излучения 590 нм (пропидиум иодид) и 530 нм (ФИТЦ). Суспензию окрашенных клеток пропускали через специальную проточную камеру. Для разделения максимумов излучения использовали светофильтры. Результаты анализа выражали в виде гистограмм для каждого из каналов, регистрирующих ДНК и белки. Недостатком этого способа представления результатов анализа является то, что двойная окраска не используется здесь для получения характерного для изучаемых клеток соотношения белок/ДНК и может быть без ущерба для точности результатов заменена раздельной регистрацией двух порций суспензии, каждая из которых окрашивается соответствующим красителем.

Наиболее полно преимущества двухволновой регистрации используются, например, в работе Торелла[ 406], в которой двухцветная окраска клеток акридиновым оранжевым. применяется для анализа популяции клеток крови. С этой целью для представление результатов используется фазовая плоскость (экран осциллографа), в которой одна из осей - интенсивность люминесценции мономеров, а другая - интенсивность люминесценции димеров. При таком способе можно увидеть разные подгруппы популяции клеток, которые характеризуется определенными средними величинами α.

Подобного типа системы особенно перспективны для целей автоматизации медицинской диагностики клеток.

Приложение 4

Энергетическая яркость в отдельных линиях ртутных ламп [мВт/см2ср нм] [362].

* Данные ориентировочны из-за самообращения линии.

Приложение 5

Энергетическая яркость ламп со сплошным спектром и фона ртутных ламп [362].

Приложение 6

Российская Академия наук

Институт биофизики клетки РАН

Научно-учебный Центр биологии клетки

(Лицензия № 24Н-0108 Минобразования РФ от 31 марта 2000 г.)

Программа курса

СПЕКТРАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ КЛЕТОК

Область знаний-510000 Естественные науки и математика)

специальность: 01160 (биофизика)

Автор курса:

к.б.н. В.Н. Карнаухов

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

Данный курс предназначен для ознакомления студентов с методами спектрального анализа внутриклеточных органелл, одиночных клеток и клеточных популяций как в живых, так и в фиксированных препаратах. Необходимость использования этих методов обусловлена большими достижениями биохимии в исследованиях выделенных из клеток и тканей физиологически активных макромолекул. Эти достижения во многом базируются на использовании методов классического спектрального анализа чистых (нерассеивающих) растворов.

Для дальнейшего движения в понимании принципов функционирования живых клеток, данные биохимии, полученные методами классического спектрального анализа, необходимо “привязать” к функционирующим одиночным клеткам, и их популяциям, используя методы спектрального анализа для изучения таких многокомпонентных и гетерогенных систем, как клетка.

Эти особенности клетки как объекта спектральных исследований создают определенные ограничения

иособенности и методов регистрации и способов интерпретации полученных результатов.

Вто же время использование методов спектрального анализа клеток создает уникальные возможности решения как фундаментальных проблем биологии, так и прикладных задач в области медицины, биотехнологии и экологии, что может быть проиллюстрировано оригинальными примерами.

Впредлагаемом курсе должно быть показано соотношение результатов спектрального анализа клеток с результатами методов классической биохимии, цитохимии и электронной микроскопии. Особое внимание будет уделено задачам, решение которых невозможно без применения спектрального анализа клеток.

ПРОГРАММА КУРСА

А: АБСОРБЦИОННЫЙ СПЕКТРАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ОДИНОЧНЫХ ЖИВЫХ КЛЕТОК.

1.Физические основы, возможности и ограничения метода. Спектры поглощения, ослабления

исветорассеяния. Особенности спектроскопии поглощающих и рассеивающих многокомпонентных гетерогенных объектов.

2.Энергетика клетки. Спектры поглощения макромолекул входящих в состав энергосистем растительных и животных клеток. Гемопротеины, каротиноиды, хлорофиллы и т.д. Функции каротиноидов в животных клетках. Разностные спектры.

3.Внутриклеточные пигменты. Спектры поглощения каротиноидов, каротинпротеинов и т.д. Функции каротинпротеинов.

4.Техника и методы эксперимента. Микроскопы и спектрофотометры, сопряжение, регистрация. Общая схема микроспектрофотометра. Ошибки и ограничения.

5.Проблемы и перспективы. Новые возможности на новой элементной базе.

Б: ЛЮМИНЕСЦЕТНЫЙ СПЕКТРАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ОДИНОЧНЫХ ЖИВЫХ КЛЕТОК.

6.Физические основы, возможности и ограничения метода. Роль светорассеяния, изменения положения максимумов при формировании сложного многокомпонентного спектра люминесценции. Флюоресценция и фосфоресценция.

7.Энергетика автотрофных клеток. Спектры люминесценции соединений, входящих в состав энергосистем растительных клеток. Хлорофиллы, фикобилины, фикоцианины и т.д. Многокомпонентность спектров реальных растительных клеток.

8.Энергетика гетеротрофных клеток. Спектры люминесценции соединений, входящих в состав энергосистем клеток животных. Пиридиннуклеотиды и фловопротеины. Определение энергетической активности клеток. Два пула митохондрий в одиночной нервной клетке.

9.Биолюминесценция и ее связь с энергетикой. Примеры спектров биолюминесценции. Особенности ее регистрации. Сверхслабое свечение тканей, хемилюминесценция.

10.Роль спектрального анализа одиночных клеток для понимания глобальных процессов. Синезеленые – вариотрофный организм. Парадоксы синезеленых. Симбионты. Адаптация биоценозов тропической зоны Океана к недостатку фосфатов в среде обитания. Красный прилив.

11.Медицинские приложения. Цитодиагностика заболеваний. Контактная микроскопия. Примеры из практики.

12.Техника и методы эксперимента. Люминесцентный микроскоп, сопряжение со спектроанализатором. Регистрация. Общая схема микроспектрофлюориметра. Ошибки и ограничения.

13.Проблемы и перспективы. Конфокальные системы, новые регистраторы, компьютерная обработка данных, времена жизни возбужденных состояний, криомикроскопия.

В: ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ СПЕКТРАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ОДИНОЧНЫХ КЛЕТОК С ПРИМЕНЕНИЕМ КРАСИТЕЛЕЙ-ЗОНДОВ.

14.Определение жизнеспособности клеток. Основы методов и подходов. Типы флюорохромов, интерпретация результатов. Акридиновый оранжевый.

15.Динамика нуклеиновых кислот в клетке. Акридиновый оранжевый, димеры и мономеры, их связь с двухспиральными (ДНК) и односпиральными (РНК) нуклеиновыми кислотами.

Параметр α и его динамика в процессе синтетической активности клетки. Выявление активной РНК и его механизм. Примеры использования для исследования нейронов и иммунокомпетентных клеток крови.

16.Белковый синтез в клетке. Двух- и трехкомпонентные окраски клеток. Флюоресцентно меченые антитела.

17.Взаимодействие макромолекул. Перенос энергии возбуждения, флюоресцентные метки, акцепторы и доноры. Примеры использования.

18.Люминесцентные красители и зонды. Краткий анализ известных данных. Примеры использования.

19.Проблемы и перспективы. Новые флюорохромы и новая техника измерений.

Г: ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ СПЕКТРАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ.

20.Двухволновая микрофлюориметрия. Основы метода, безразмерные параметры. Техника эксперимента и примеры приложений в биологии, медицине и экологии.

21.Системы поиска нетипичных (патологических) клеток. Основы метода, примеры реализации.

22.Проблемы и перспективы. Новая элементная база, новые возможности.

Д: ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

23.Комбинация нескольких методов применительно к одному и тому же микрообъекту. Техника эксперимента, интерпретация данных. Примеры применения.

24.Проблемы и перспективы. Новые методы спектрального анализа клеток. Возможности и перспективы.

Список рекомендуемой литературы

1.Свенсон К., Уэбстер П. Клетка. Мир. М. 1980. С. 1-300.

2.Де Дюв К. Путешествие в мир живой клетки. Мир. М. 1987. С. 1-256.

3.Марголис. Эволюция клетки. Мир. М.

4.Карнаухов В.Н. Функции каротиноидов в клетках животных. Наука. М. 1973. С. 1-107.

5.Карнаухов В.Н. Биологические функции каротиноидов. Наука. М. 1988. С. 1-240.

6.Карнаухов В.Н. Люминесцентный спектральный анализ клеток. Наука. М. 1978. С. 1-204.

7.Карнаухов В.Н., Яшин В.А. Спектральный анализ морского микропланктона. Пущино. 1980. С. 1- 40.

8.Карнаухов В.Н., Карнаухова Н.А., Яшин В.А. Методы и техника люминесцентной цитодиагностики.

9.Карнаухова Н.А. Люминесцентные параметры ядерных клеток крови в процессе иммунного ответа организма. Биофизика. Т. 29. №2. С. 267-279.

10.Карнаухов В.Н. Спектральный анализ клеток в экологии и охране окружающей среды. ОНТИ НЦБИ РАН, Пущино. 1988. С. 1-104.

11.Рощина В.Д., Рощина В.В. Выделительные функции высших растений. Наука. М. 1989. С. 1-214.

12.Рощина В.В., Мельникова Е.В., Карнаухов В.Н., Головкин Б.Н. Применение микроспектрофлюориметрии в спектральном анализе секреторных клеток растений. Изв. РАН.

Сер. биол. 1997. №2. С. 167-171.