ПРЕДИСЛОВИЕ

Бурное развитие биохимии и молекулярной биологии за последние два десятилетия выдвинуло на передний план задачу изучения молекулярной организации функциональных механизмов живой клетки и процессов регуляции, интегрирующих их в единую живую систему. Именно эти механизмы обеспечивают возможность выполнения плеткой функций: рост, смену поколений, приспособление к меняющимся условиям среды и к взаимодействию клеток.

Огромное количество ферментных процессов, протекающих в клетке, координируется системами регуляции, и потому они строго разграничены не только в пространстве в специальных структурных элементах клетки (ядро, митохондрии, эндоплазматический ретикулум, лизосомы, пероксисомы и т. д.), но достаточно четко распределены также и во времени. Таким образом, число реакций, одновременно протекающих в том или ином органоиде клетки, не настолько велико, чтобы отказаться от попыток установить их последовательность и взаимосвязь в живой системе.

Это тем более необходимо, что нарушения в системах регуляции, обеспечивающих временную и пространственную организацию биохимических реакций в клетке, являются, по-видимому, причиной различных патологических явлении, включая сердечно-сосудистые заболевания и рак.

Постановка задачи об изучении внутриклеточной регуляции обмена веществ и энергии требует, естественно, развития и внедрения в значительной мере новых методов и новой техники эксперимента. Важнейшими из них являются методы спектрального анализа, позволяющие изучать физико-химические процессы, протекающие непосредственно в живой клетке и ее органоидах.

Возможности спектрального анализа связаны, прежде всего, с тем обстоятельством, что многие молекулы, входящие в состав функциональных механизмов клетки, обладают весьма характерными спектрами поглощения, а зачастую — и люминесценции. В ряде случаев эти спектральные характеристики подвергаются значительным изменениям, отражая те изменения в структуре данной молекулы и ее окружения, которые служат физико-химической основой биологической функции. Например, регистрация люминесцентных характеристик таких ключевых компонентов окислительного метаболизма, как НАД Н и флавопротеины, открывает возможность тонкого слежения за состоянием энергетического аппарата клетки.

В тех же случаях, когда собственные спектральные характеристики представляющих интерес компонентов клетки оказываются недостаточно выразительными, имеется возможность использования специфических красителей-меток. В их числе оказываются как старые, хорошо известные в люминесцентной микроскопии и цитохимии флуорохромы-метки нуклеиновых кислот, белков, липидов и др., так и класс относительно новых меток-флуорохромов, тонко реагирующих на изменение структуры помеченных ими молекул, входящих в состав полимолекулярных комплексов,

осуществляющих элементарные функции в живой системе.

Все эти вопросы в той или иной мере представлены в соответствующих разделах данной монографии. Однако при относительно большом объеме ее не может быть сделана попытка одинаково подробного рассмотрения всех возможных аспектов применения столь широкого и перспективного по своим возможностям метода, как люминесцентный спектральный анализ. Поэтому представлялось полезным в каждой главе выделить для иллюстрации основных положений, методических подходов, проблем и перспектив метода одну из задач молекулярной физиологии клетки за счет краткого, по необходимости, рассмотрения остальных.

Реализация широких возможностей метода во многом зависит от наличия рационально построенных систем регистрации. Поэтому техническому и приборному обеспечению уделено достаточно большое внимание не только в специальной главе, где рассматриваются вопросы общего характера, но и в остальных главах, где оказывается уместным обсудить некоторые технические и методические приемы более узкого назначения.

Монография не ставит своей задачей описание развития различных идей в историческом плане, и потому в ней цитированы только те из известных автору работ, знакомство с которыми, по его мнению, будет полезно читателю в практической деятельности.

Автор считает приятным долгом выразить глубокую благодарность своим сотрудникам, участвовавшим в создании описываемой техники и методов люминесцентного анализа клеток, проводившим ряд различных экспериментов и помогавшим при оформлении рукописи: В.А. Яшину, В.И. Кулакову, В.В. Дудареву, Е.В. Мельниковой, В.П. Зинченко, О.Е. Лебедеву, П. П. Марценюку и многим другим, совместная работа с которыми позволила накопить опыт, предлагаемый вниманию читателя.

В.Н.Карнаухов

Оглавление

Предисловие Глава 1. Определения и общие закономерности люминесценции

1.1.Физические основы люминесценции

1.2.Возбуждение и измерение интенсивности люминесценции клетки Глава 2. Собственная люминесценция клеток

2.1.Спектральные характеристики собственной люминесценции клеток

2.2.Функциональная активность клетки и регуляция энергетического аппарата

Глава 3. Люминесцентные красители. 1. Изучение внутриклеточного обмена веществ

3.1.Двухволновые методы определения соотношения концентрации нуклеиновых кислот

3.2.Определение соотношений различных веществ в клетке

3.3.Анализ спектральных характеристик

Глава 4. Люминесцентные красители. 2. Исследование динамики функциональной организации клеточных структур

4.1.Взаимодействие контрактильных белков в процессе мышечного сокращения

4.2.Изучение динамики кальция при функционировании клеток

4.3.Исследование структуры мембраны при генерации потенциала действия

4.4.Взаимодействие белков и нуклеиновых кислот

ПРИЛОЖЕНИЕ

Приборы и техника люминесцентного спектрального анализа клеток

Введение Приложение 1

П1. Микроспектрофлуориметры

П1.1. Микроспектрофлуориметр на базе стандартных деталей и узлов П1.2. Микроспектрофлуориметр для морфологических исследований

на базе стандартных узлов П1.3. Малогабаритный инвертированный микроспектрофлуориметр

П1.4. Экспедиционный микроспектрофлуориметр с интерференционным светофильтром переменной длины волны

П1.5. Бесщелевой микроспектрофлуориметр с фоторегистрацией П1.6. Высокоапертурный бесщелевой спектрофлуориметр П1.7. Микроспектрофотометр для изучения фосфоресценции клеток

Приложение 2

П2. Микрофлуориметры

П2.1. Трехканальный микрофлуориметр П2.2. Двухканальный импульсный микрофлуориметр

П2.3. Двухканальные поляризационные микрофлуоримегры П2.4. Двухканальный микрофлуориметр с раздельным возбуждением

Приложение 3

П3. Приборы и методы автоматического анализа клеточных популяций

Приложение 4

Энергетическая яркость в отдельных линиях ртутных

ламп [мВт/см2ср нм]

Приложение 5

Энергетическая яркость ламп со сплошным спектром и фона ртутных ламп [362].

Список первоисточников Приложение 6

Программа курса «СПЕКТРАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ КЛЕТОК»

Список рекомендуемой литературы

Возвращаясь к рассмотрению основных закономерностей явления люминесценции, следует, прежде всего, отметить, что поступающая извне избыточная энергия возбуждения может быть поглощена молекулой с переходом в возбужденное состояние только в том случае, если ее величина равна разнице энергий основного (So) и одного из возбужденных состояний данной молекулы. В частном случае фотолюминесценции, приведенном на рис.1, это означает, что для перехода молекулы с основного уровня So на первый возбужденный уровень S1 (с разницей энергии E1 необходим квант света с такой же энергией:

где h — постоянная Планка, равная 6,62 10-27 эрг с, ν - частота электромагнитных колебаний света (с- 1). Или, учитывая, что

При соблюдении этих условий молекула может поглотить квант света и за время, равное периоду световых колебаний (10-15 с), переходит из основного состояния So в возбужденное состояние S1 как это показано вертикальной стрелкой «Возбуждение» на рис.1. Ввиду того, что за столь малый отрезок времени (10-15 с) расстояние между составляющими молекулу атомами не успевает существенно измениться, согласно принципу Франка - Кондона, молекула оказывается на одном из высших колебательных подуровней возбужденного состояния S1 и требуется определенное время для рассеяния соответствующей порции энергии Ek 1, чтобы молекула оказалась в низшей точке энергетической кривой S1. Как уже упоминалось выше, возбужденное состояние молекулы S1 является нестабильным, и через некоторое время (t ≈ 10-8 с) она возвращается в исходное основное состояние So, излучая избыточную энергию E2 в виде кванта света с длиной волны λ2 , определяемой уравнением E2 = hc/λ2. При возвращении молекулы в основное состояние она вновь оказывается, в соответствии с принципом Франка - Кондона, на одном из высших колебательных подуровней

(3) длина волны излучения λ2 оказывается больше длины волны возбуждающего кванта λ1. Это характерное для люминесценции соотношение лежит в основе установленного эмпирическим путем закона Стокса. Существуют, однако, случаи, когда за счет внутреннего перераспределения энергии длина волны люминесценции оказывается меньше длины волны возбуждающего кванта. Эта разновидность носит название антистоксовой люминесценции.

Рассмотренные переходы между основным So и возбужденным S1 состояниями характеризуются одной весьма важной особенностью, а именно - неизменностью состояния спинов электронов в молекуле. Обычно молекулы в основном состоянии содержат четное число электронов со «спаренными» спинами, т.е. число электронов со спином s = + ½ равно числу электронов со спином s = - ½, и, следовательно, суммарный спин S всех электронов молекулы равен 0. В результате мультиплетность молекулы М = 2S + 1, где S — суммарный спин молекулы, оказывается равной 1, или, как говорят, молекула находится в синглетном состоянии.

Наиболее вероятными энергетическими переходами являются переходы без изменения мультиплетности, т. е. cинглет → синглетный (So → S1) переход при поглощении кванта возбуждения и обратный переход S1 → So при дезактивации молекулы. Этот тип люминесценции называется

флуоресценцией.

Может, однако, оказаться, что в результате некоторого внутреннего энергетического перехода спин одного из электронов молекулы изменит знак и в ее составе появятся два неспаренных электрона. Тогда суммарный спин молекулы S1= ½+ ½ = 1 и мультиплетность М == 2S + 1 = 3. Такое состояние молекулы принято называть триплетным.

Внутренняя потенциальная энергия первого триплетного состояния (кривая Т) ниже энергии первого синглетного состояния (S1), и поэтому доля энергии E3 , излучаемой в виде света при переходе молекулы из возбужденного триплетного состояния (T1) в основное синглетное состояние (So), ощутимо уменьшается, а длина волны излучаемого при этом света (см. уравнение 3) увеличивается по сравнению с флуоресцентньм переходом S1 → So ( E2 ). Этот тип люминесценции

(триплет-синглетный переход) называется фосфоресценцией.

Помимо большей длины волны излучаемого света фосфоресценция отличается от флуоресценции и большим временем жизни молекулы в возбужденном состоянии. Это связано с тем обстоятельством, что переходы между энергетическими уровнями с изменением мультиплетности являются «запрещенными», т. е. вероятность их очень мала. Ввиду большой длительности времени жизни возбужденной молекулы в триплетном состоянии (T1) появляется вероятность того, что за счет поглощения тепловой энергии она может возвратиться на возбужденный синглетный уровень S1 и уже с него перейти на основной уровень So , излучая квант света. Поскольку разница энергий в этом случае составляет E2, длина волны излучения остается такой же, как и в обычном случае флуоресценции, и только время жизни возбужденного состояния оказывается большим (за счет пребывания на триплетном уровне T1), и этот тип флуоресценции называется замедленной флуоресценцией.

Из изложенного выше становится ясной принципиальная значимость такого параметра люминесценции, как время жизни молекулы в возбужденном состоянии. Для определения этого параметра существуют различные способы, наиболее прямой из которых состоит в том, что после прекращения возбуждения интенсивность люминесценции уменьшается по закону

где I —интенсивность люминесценции в момент времени t после прекращения возбуждения; Io - интенсивность люминесценции до прекращения возбуждения; τ - среднее время жизни возбужденного состояния.

Из выражения (4) следует, что величина τ представляет собой время, за которое интенсивность люминесценции уменьшится до 1/е от исходного значения.

Даже из весьма поверхностного рассмотрения ясно, что флуоресценция и фосфоресценция значительно различаются по своей внутренней природе и, как следствие, по своим закономерностям. Поэтому нежелательно употребление этих терминов без точного установления природы излучения; и более правильным в случаях, когда нет полной уверенности в том, является ли изучаемое свечение флуоресценцией или фосфоресценцией, является употребление термина люминесценция.

При этом необходимо отметить, что, хотя, как это упоминалось выше, фосфоресценция в растворах имеет обычно значительно большее время жизни возбужденного состояния τ, знание этого параметра может оказаться недостаточным при изучении люминесценции клеточных структур, так как он отражает только наличие «запрета» на триплет-синглетный переход в растворе. В специальным образом упорядоченной среде клеточных структур стерические взаимодействия люминесцирующей молекулы со средой могут, по-видимому, приводить к снятию запрета и значительному уменьшению времени жизни фосфоресценции, делая ее мало различимой по этому параметру от флуоресценции. Лабильность же биологических структур в процессе их функциональных перестроек может приводить к вариабельности τ фосфоресцирующей молекулы, и это следует иметь в виду.

Одним из важнейших параметров люминесценции молекулы является ее квантовый выход k, определяемый как отношение числа квантов люминесценции (nл) к числу поглощенных за то же время молекулой квантов возбуждающего излучения (nп):

При отсутствии каких-либо процессов, кроме люминесценции, число поглощенных квантов равно числу квантов люминесценции и k = 1. Однако молекула может вернуться из возбужденного состояния не только путем излучения избыточной энергии в виде света. Возможны такие процессы, как передача энергии возбуждения другой молекуле, фотохимическая реакция, рассеяние энергии в виде тепла при участии окружающей среды и т. д. Все эти процессы приводят к тому, что доля молекул, дезактивация которых происходит за счет люминесценции, уменьшается, а может и вообще стать близкой к нулю.

Следует иметь в виду, что молекула люминесцирующего вещества, взаимодействуя со специфически организованными биологическими макромолекулами и их комплексами, может резко менять свой квантовый выход как в сторону уменьшения (например, за счет миграции энергии возбуждения), так и в сторону увеличения. Например, краситель аурамин 00, практически не люминесцирующий в растворе ввиду исключительной способности к рассеянию энергии безызлучательным путем за счет большой подвижности частей своей молекулы, после взаимодействия с белком приобретает жесткость молекулярной структуры и как следствие - высокий квантовый выход.

1.2. Возбуждение и измерение интенсивности люминесценции клеток

Как было упомянуто выше, один из основных способов возбуждения люминесценции состоит в использовании квантов света с более короткой, чем у люминесцентного излучения, длиной волны. При этом существуют различные способы возбуждения люминесценции микрообъекта для последующего микроскопического изучения его. Простейший способ представлен на рис. 2, I и заключается в том, что из суммарного светового потока источника (1), сформированного коллекторной линзой (2), узкополосным фильтром (3) вырезается необходимое для возбуждения излучение, лежащее в узком спектральном интервале. Это излучение конденсором (4) фокусируется на микрообъект (5) и возбуждает его люминесценцию. Свет люминесценции объекта (5) и прошедшее через объект возбуждающее излучение (на 2-3 порядка более интенсивное, чем люминесценция) собирается микрообъективом (6), формирующим изображение микрообъекта в фокальной плоскости окуляра (8), Расположенный между микрообъективом (6) и окуляром (8) запирающий светофильтр (7) предназначен для полного устранения прошедшего через микрообъект

(5) возбуждающего излучения, что дает возможность рассматривать через окуляр (8) изображение микрообъекта в свете его люминесценции.

Рис. 2. Способы возбуждения и регистрации люминесценции микрообъекта:

I – наблюдение в проходящем свете;

II – система с темнопольным пораболоидконденсором;

III – освещение по методу темного поля с кардиоид-конденсором.

Недостатки этого способа, называемого возбуждением люминесценции в проходящем свете, очевидны. Во-первых, наиболее ярко люминесцируют нижние слои микрообъекта, в то время как наиболее удобны для наблюдения верхние слои, т.е. способ применим только для достаточно тонких срезов. Вторая особенность, хотя и не носит принципиального характера, тем не менее накладывает серьезные ограничения на применение этого метода и состоит в трудности отделения проходящего через объект интенсивного возбуждающего излучения.

Именно с целью отделения возбуждающего излучения от люминесценции объекта и были разработаны системы темнопольного возбуждения с применением параболоидных (рис. 2, II) и кардиоидных. (рис. 2, III) конденсоров. Как видно из приведенных на рис. 2 схем, прямое возбуждающее излучение в этих случаях не попадает в микрообъектив (6), а рассеянное микрообъектом (5) возбуждающее излучение малой интенсивности достаточно легко устраняется запирающим светофильтром (7). К числу недостатков этих схем относится малая толщина микрообъекта и определенные ограничения на возможность использования высокоапертурных конденсоров и микрообъективов, что снижает яркость люминесценции объекта, хотя при работе с тонкими флуорохромированными срезами и микрообъектами они позволяют получить хорошие результаты.

Необходимость исследования толстых образцов, а тем более клеток in situ (т.е. лежащих на поверхности органа, не выделенного из организма живого животного), привела к разработке схем фронтального возбуждения падающим на объект излучением (рис. 3).

Применение с этой целью эпиобъективов (рис. 3, I), хотя и позволяет решить поставленную задачу исследования толстых препаратов, однако, достигается это достаточно дорогой ценой - уменьшением апертур как осветителя конденсора (4), так и микрообъектива (6), что приводит к значительному снижению яркости люминесценции микрообъекта.

Рис. 3. Фронтальное возбуждение с эпиобъективом (I) и с применением интерференционной светоделительной пластинки по методу Брумберга (II).

В этом отношении, по-видимому, наиболее перспективным является метод возбуждения, при котором один и тот же высокоапертурный микрообъектив (4, 6) (рис. 3, II) используется и для концентрирования возбуждающего излучения на объекте (5) и для сбора люминесцентного излучения этого объекта [17]. Основным преимуществом такой схемы является максимально высокая яркость люминесценции препарата, пропорциональная четвертой степени апертуры микрообъектива [18]. Яркость люминесценции Ф препарата определяется уравнением:

где Ф - яркость люминесценции; К - коэффициент, характеризующий особенности прибора и свойства препарата; Фо - яркость источника возбуждающего излучения; А1 - апертура микрообъектива, собирающего люминесцентное излучение препарата; А2 - апертура конденсора, концентрирующего на препарате возбуждающее излучение; β - увеличение объектива; Г - увеличение окуляра.

Для случая, когда один и тот же объектив используется и для концентрации возбуждающего излучения на объекте и для сбора люминесцентного излучения объекта, уравнение (6) приобретает вид:

Из этого уравнения следует, что для достижения максимальной яркости люминесценции необходимо стремиться к увеличению апертуры объектива. Увеличение апертуры микрообъектива Х10 от 0,2 до 0,4, например, увеличивает яркость люминесценции препарата в 16 раз при прочих равных условиях. Именно эта высокая начальная яркость препарата дает возможность достаточно просто осуществлять в дальнейшем спектральный анализ его люминесцентного излучения с хорошим соотношением сигнал/шум.

Применение такой (рис. 3, II) системы фронтального возбуждения люминесценции стало целесообразным только после введения Е.М. Брумбергом и А.С.Гершгориным [19] специального опак-иллюминатора (рис. 3, II, 9), представляющего собой светоделительную пластинку с интерференционным покрытием. Спектральные характеристики этих пластинок (см. ниже) таковы, что они избирательно отражают на объект под углом 90° излучение УФ или сине-фиолетовой области спектра, используемое для возбуждения люминесценции препарата (5), и свободно пропускают свет люминесценции препарата, лежащий в видимой области спектра.

Наличие этих интерференционных светоделительных пластинок [20] является ценной особенностью отечественных люминесцентных микроскопов [21], позволяющих проводить самые разнообразные исследования клеток.

В поле зрения люминесцентного микроскопа перед глазами исследователя открываются изумительные по своей красоте многоцветные картины собственной и вторичной люминесценции клеток (см. вкл.). Однако при всей своей высочайшей чувствительности к слабым световым потокам

ик цветовым оттенкам их глаз человека как измерительный прибор обладает одним существенным недостатком - отсутствием объективности. Оснащение микроскопа дополнительными спектральными

иэлектронными устройствами позволяет перевести эти многокрасочные картины на язык объективных цифровых данных об интенсивностях люминесценции в определенных длинах волн.

Интенсивность люминесценции Iл вещества определяется выражением

веществом возбуждающего люминесценцию излучения, определяемая, согласно закону Ламберта - Бугера - Бера, уравнением:

При условии, что доля поглощаемого веществом излучения мала и составляет не более 5% падающего на объект излучения (а это условие практически всегда реализуется, особенно при микроспектральных исследованиях), уравнение (8) упрощается и принимает вид:

где Iо - интенсивность падающего на объект возбуждающего люминесценцию излучения; ε - молярный коэффициент поглощения; с - концентрация поглощающего и люминесцирующего вещества; d - длина оптического пути возбуждающего люминесценцию излучения в объекте.

Тогда уравнение (7), определяющее интенсивность люминесценции вещества, с учетом выражения (8') приобретает вид:

При изучении люминесценции гомогенного мономолекулярного раствора какого-либо вещества с постоянным квантовым выходом в кювете толщиной d в правой части уравнения (9) остается только одна переменная величина с — концентрация вещества в растворе. В этом случае интенсивность люминесценции Iл пропорциональна (в определенных пределах) концентрации люминесцирующего вещества с, что и используется в практике люминесцентного анализа растворов.

При исследованиях же на клеточном уровне ситуация резко изменяется. Клетка как объект спектральных исследований представляет собой многокомпонентную гетерогенную полидисперсную систему, весьма сложным образом взаимодействующую с люминесцентной меткой и падающим на объект излучением [22—24]. В этом случае в правой части уравнения (9) оказывается по крайней мере три переменных k, c, d, изменение которых будет приводить к изменению интенсивности регистрируемой люминесценции Iл. Объединяя постоянные члены уравнения (9) в постоянный коэффициент А, получаем

Это означает, что если, например, в двух участках одной и той же клетки зарегистрированы спектры люминесценции (рис. 4, 1, 2), то в общем случае без привлечения дополнительных данных нет возможности определить, связано ли изменение интенсивности люминесценции Iл с изменением концентрации с люминесцирующей молекулы в изучаемых участках клетки, обязано ли оно своим происхождением изменению квантового выхода люминесценции k или изменению длины оптического пути возбуждающего люминесценцию излучения в объекте.

Рассмотрение влияния этих переменных на величину измеряемой интенсивности люминесценции удобно начать с последнего из перечисленных параметров, а именно с d - длины оптического пути возбуждающего излучения в препарате, полагая при этом постоянным квантовый выход k. Полидисперсность клетки приводит к возникновению многократного рассеяния и отражения светового луча на внутриклеточных органоидах, таких, как ядро, митохондрии, эндоплазматический ретикулум, рибосомы, аппарат Гольджи, микротельца и т. д. Ввиду большой вариабельности коэффициентов преломления этих органоидов, по-видимому, не существует удовлетворительного теоретического подхода, позволяющего рассчитать рассеяние в столь сложной полидисперсной среде, тем более, что значительная часть рассеивающих частиц лежит за пределами разрешения светового микроскопа и распределение их по форме и размерам остается неизвестным. В то же время размеры, форма и коэффициент преломления этих частиц, меняясь в широком диапазоне, определяют рассеивающие свойства объекта [25, 26]. Это означает, что даже при условии постоянства квантового выхода люминесцирующего вещества получение абсолютных данных о его концентрации в клетке по измеренной интенсивности люминесценции - крайне трудная задача.

Учитывая, однако, что в большинстве случаев представляют интерес не столько данные об абсолютной концентрации вещества, сколько сведения о динамике этой концентрации в процессе тех или иных изменений функционального состояния клетки, достаточно было бы потребовать постоянства рассеивающих свойств объекта (а следовательно, и длины оптического пути

трудно учитываемых условий, с целью повышения точности и сопоставимости данных перед построением гистограммы прибегают к нормированию результатов путем, например, их деления на величину средней интенсивности люминесценции в контроле. Гистограммы распределения (рис. 6)

Рис. 6. Гистограммы, характеризующие интенсивность люминесценции ядер интактной печени через 2,5 ч после (а) и до (б) гепатэктомии [49]. По оси абсцисс – отношение интенсивности люминесценции отдельных ядер печени через 2,5 ч после (IОП) и до операции (IК) к средней интенсивности люминесценции ядер до операции в каждом опыте (ĪК); по оси ординат – количество клеток. Окрашено акридиновым оранжевым.

нормированных таким образом величин интенсивностей зеленой (λ==530 нм) люминесценции ядер клеток печени, окрашенных акридиновым оранжевым, отражают, по-видимому, распределение концентрации ДНК в данном объекте [49]. Интересно отметить, что по форме гистограмма интактной печени (рис. 6, б) ближе к гистограмме, характерной для синхронизированной культуры клеток (рис. 5, б). Частичная гепатэктомия приводит, по-видимому, к ослаблению тканевой регуляции интенсивности деления клеток, и гистограмма их ядер (рис. 6, а) становится близкой по форме к гистограмме распределения ДНК в ядрах свободно растущей культуры клеток (рис. 5, а).

В общем же случае при изучении динамики концентраций веществ в клетке в процессе изменения ее состояния, по-видимому, нельзя пренебречь изменениями ее рассеивающих свойств (а следовательно, d) в этом процессе. Например, увеличение синтетической активности клетки может сопровождаться ростом в ней числа рибосом, что приведет к увеличению интенсивности люминесценции флуорохрома, специфически связывающегося с РНК не только за счет увеличения концентрации РНК в клетке, но и за счет увеличения длины пути возбуждающего излучения d в препарате в результате увеличения в нем количества рассеивающих частиц (рибосомы, мембраны эндоплазматического ретикулума и т. д.). Поэтому учет изменения рассеивающих свойств объекта в общем случае остается необходимым, что методически приводит к переходу на двухили многоканальную регистрацию интенсивности люминесценции в двух или более спектральных интервалах или на регистрацию спектра люминесценции объекта.

Принципиальная схема микроспектрофлуориметра - прибора, предназначенного для регистрации спектров люминесценции одиночных клеток и их участков, - приведена на рис.7. Ее основная часть представляет собой комбинацию люминесцентного микроскопа (рис. 7, 1—10) с интерференционной светоделительной пластинкой (см. рис.3, II), диспергирующей системы (8, 11, 12) и регистрирующего устройства (13, 14), а также не показанных на схеме источников питания. Что касается двух дополнительных систем (15—21), то они предназначены именно для контроля рассеивающих свойств препарата в исследуемой области.

Работа микроспектрофлуориметра осуществляется следующим образом. Из сформированного коллекторной линзой (2) излучения источника (1) узкополосным фильтром (3) вырезается возбуждающее излучение в узком спектральном диапазоне λ1. Это излучение отражается интерференционной светоделительной пластинкой (4) и фокусируется микрообъективом (5) на объект исследования (6), вызывая его люминесценцию. Люминесцентное излучение объекта собирается микрообъективом (5) и, проходя через интерференционную пластинку (4), формирует на поверхности сферического зеркала (8) люминесцентное изображение микрообъекта (6), которое визуально изучается с помощью системы, состоящей из окуляра (10) и зеркала (9). Между интерференционной пластинкой (4) и зеркалом (8) размещается широкополосный светофильтр, отрезающий отраженное и рассеянное микрообъектом возбуждающее излучение λ1.

На поверхости сферического зеркала (8) имеется свободный от отражающего покрытия участок - зонд. Поэтому люминесцентное излучение, создающее изображение клетки, совмещенное с

зондом, свободно проходит через зондовое отверстие в диспергирующую систему (обычно монохроматор) для спектрального анализа. При этом отверстие зонда служит не только полевой диафрагмой микроскопа, ограничивающей размеры анализируемого участка микрообъекта (6), но и входной щелью монохроматора (12). За выходной щелью монохроматора размещается приемник излучения (13) (обычно - фотоэлектронный умножитель), выходной сигнал которого (в случае необходимости - через усилитель-согласователь) подается на ось Y двухкоординатного самописца (14), развертка Х которого тем или иным способом синхронизирована с разверткой монохроматора (12). При включении развертки монохроматора на самописце регистрируется спектр люминесценции участка микрообъекта (6), изображение которого совмещено с зондом в зеркале (8).

синтерференционным – конденсор;

Для учета изменения рассеивающих свойств препарата в такой системе (или в ее упрощенной модификации - микрофлуориметре, когда монохроматор (12) заменен узкополосным светофильтром, пропускающим в максимуме излучения люминесценции) можно воспользоваться измерением интенсивности проходящего через микрообъект (6) возбуждающего излучения λ1. С этой целью прошедшее через объект (6) излучение собирается конденсором (15) и с помощью поворотного зеркала (16) через светофильтр (20), пропускающий излучение с длиной волны λ1, направляется на фотоумножитель (21) для преобразования в электрический сигнал. В дальнейшем этот электрический сигнал может быть использован либо для постоянного контроля как поглощения и рассеяния возбуждающего излучения в объекте (6), так и стабильности источника (1), либо для автоматической компенсации изменения этих величин.

Несколько меньших затрат требует другой способ контроля рассеивающих и поглощающих свойств препарата, который заключается в использовании дополнительного стабильного источника света (19) (обычно - лампа накаливания). При этом из светового потока источника (19), сформированного коллекторной линзой (18), узкополосным (обычно интерференционным) светофильтром (17) вырезается узкая полоса, лежащая в свободной от полос люминесценции (λ2 , λ3 на планшете 14, рис.7) области спектра (λ4). С помощью поворотного зеркала (16) и конденсора (15) это дополнительное излучение фокусируется на микрообъект (6) и, проходя через него, примешивается к люминесцентному излучению объекта и потому регистрируется в виде узкой полосы в соответствующей области спектра (λ4). Интенсивность этой полосы характеризует рассеяние и поглощение в объекте (6) и степень стабильности регистрирующей системы (13, 14).

Таким образом, учет изменения в препарате длины оптического пути d возбуждающего люминесценцию излучения, причиной которого может быть изменение как рассеивающих свойств препарата, так и его толщины, а также учет возможной нестабильности измерительной системы в целом приводит к значительным усложнениям техники и методики эксперимента, не гарантируя полностью при этом высокую точность измерений.

Поэтому представляется заманчивым такое построение эксперимента, при котором перечисленные выше факторы перестают оказывать влияние на точность результатов измерения. Эта возможность возникает, в частности, когда необходимо знать не столько изменение (в относительных единицах) концентрации каких-либо химических компонентов клетки, сколько изменение соотношения концентраций этих соединений при развитии того или иного внутриклеточного процесса. Например, одной из важных характеристик состояния клетки может служить отношение концентраций РНК/ДНК (т.е. количество РНК, синтезируемой на единицу ДНК), которое может рассматриваться как количественная характеристика интенсивности синтетических процессов в клетке. При этом можно независимо измерить концентрации РНК и ДНК и путем деления получить величину искомого параметра.

Однако предпочтительнее произвести одновременное измерение в одном и том же препарате непосредственно отношения концентраций двух представляющих интерес внутриклеточных соединений. Преимущества такого построения эксперимента вытекают из анализа уравнения (9'). Действительно, если в одном и том же объекте двумя флуорохромами с достаточно далеко расположенными максимумами излучения пометить два изучаемых биополимера, то спектр люминесценции исследуемого участка такого объекта будет иметь вид двугорбой кривой, приведенной на рис. 8.

Рис. 8. Схема двухволнового метода регистрации.

При этом интенсивности люминесценции одного из участков клетки в максимумах излучения λ1 и λ2 будут определяться согласно уравнению (9'):

при использовании флуорохромов с постоянным квантовым выходом оказывается пропорциональным отношению концентрации флуорохромов, связанных с биополимерами, и не зависит от интенсивности возбуждающего люминесценцию излучения Iо и длины оптического пути этого излучения в препарате. Изменение любого из этих параметров приведет к одновременному изменению амплитуды обеих полос люменесценпии (рис. 8, 2), однако не скажется на величине их отношения. Только изменение соотношения концентрации красителей (а стало быть, помеченных ими веществ) приведет к изменению соотношения интенсивностей полос люминесценции Iлλ1 и Iлλ2 (рис. 8, 3). Аналогичным образом может быть поставлен эксперимент с тремя и более флуорохромами-метками. При этом вопросы экранирования, реабсорбции и миграции энергии с одного красителя на другой подлежат рассмотрению для конкретной ситуации того или иного метода.

Флуорохромы с постоянным квантовым выходом люминесценции являются основными красителями, используемыми обычно в классической люминесцентной цитохимии, когда основная задача заключается в установлении концентрации тех или иных биополимеров клетки. В качестве примера могут быть названы флуоресцеин, акридиновый оранжевый, эозин и т. д. В то же время существуют красители, квантовый выход которых сильно меняется при связывании их с различными компонентами клеточных структур и зависит от окружения. Такого типа люминесцентные метки оказываются наиболее удобными при изучении не столько концентрации биополимера, сколько его структурного состояния и имеют большое значение в исследовании молекулярной организации различных функциональных механизмов клетки.

Примером люминесцентных меток с переменным квантовым выходом может служить широкоизвестный АНС (8-анилено-1-нафталено-сульфонат). Свойство этого красителя, заключающееся в резком увеличении квантового выхода люминесценции (в 20 - 100 раз) при абсорбции его на гидрофобную область белков [50], было использовано для изучения конформации молекулы гемоглобина, наблюдения локальных деформаций мышечных белков [51 - 52], определения локализации гидрофобных участков в саркомере поперечно-полосатой мышцы [53, 54] и наблюдения изменения структуры мембран митохондрий [55 - 56] и нервных волокон [57]. Меток этого типа довольно много, и АНС не является единственным в своем роде. Такие красители, как этидиум бромид, тетрациклин, аурамин, мероцианины и др., с успехом применяются при изучении молекулярной организации функциональных механизмов клетки [58 - 63]. Даже красители с