2 курс / Гистология / Введение_в_иммуноцитохимию_Полак_Дж_,_Ван_Норден_С_

ПРЕДИСЛОВИЕ РЕДАКТОРА ПЕРЕВОДА

Приемы иммуноцитохимии, позволяющие определять мес­ то реакции антиген— антитело в клеточных и тканевых струк­ турах, находят все более широкое применение при ультраструктурном описании физиологических и патологических явлений. М етод иммуноцитохимии, предложенный еще в 40— 50-х годах, постоянно развивается. Его совершенствование находится в прямой зависимости от прогресса составляющих его основу наук — иммунологии, белковой химии, биохимии клеток и тканей, оптики, вклю чая электронную и другие ви­ ды микроскопии. О бъединяя возможности методов упомяну­ тых наук, иммуноцитохимия в приблизительно равной мере становится исследовательским приемом и иммунологов, и биохимиков, и морфологов-микроскопистов (цитологов, гисто­ логов, патологов). Вот почему для успешного применения им­ муноцитохимии требуются достаточно глубокие знания как фундаментальных основ иммунологии, биохимии (иммунохи­ мии), микроскопии, так и принципов соответствующих мето­ дических подходов. Соответственно и в кратком методическом руководстве должны содерж аться наиболее существенные сведения, определяющие осознанное восприятие и при­ менение различных модификаций иммуноцитохимического ме­ тода. П редлагаем ая читателю книга «Введение в иммуноци­ тохимию: современные методы и проблемы» (она принадле­ жит издаваемой в Англии серии «Руководства по микроско­ пии») отвечает этому требованию . В книге удачно дано крат­ кое изложение научных основ метода и приводятся четкие и конкретные методические рекомендации. Авторы, не прибегая к упрощениям, в доступной форме излагаю т теоретические и практические аспекты основных иммуноцитохимических прие­ мов, вошедших в практику биологов и патологов. В первых разделах приводятся краткие сведения об истории развития ме­

том числе моноклональных, описаны методы их тестирования. Специальные разделы посвящены работе с растворимыми и нерастворимыми антигенами, визуализации иммунологической реакции. Д алее рассматриваю тся иммунофлуоресцентные и иммуноферментные методы и различные их модифика­

ции, используемые в светооптической и электронной микро­ скопии. Особое внимание авторы уделяют проблемам специ­ фичности реакции, грамотного проведения контролей и объек­ тивной трактовке результатов. Читателю , прежде всего на­ чинающему осваивать и применять метод иммуноцитохимии,

Книгу следует рекомендовать прежде всего широкому кру­ гу биологов, врачам-патологам, начинающим использовать иммуноцитохимические методы. В то ж е время специалисты, имеющие соответствующую подготовку и опыт в иммуноцито­ химии, найдут в книге много полезного. М ожно с уверенно­ стью утверждать, что данное практическое руководство ока­ жется настольной книгой для многих исследователей.

Н. Г. Хрущ ов

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Определение

Иммуноцитохимия — это метод, основанный на использо­ вании меченых антител для локализации компонентов (анти­ генов) ткани in situ.

1.2. История и развитие метода

Основателями иммуноцитохимии по праву принято считать группу исследователей, возглавляемую Альбертом Кунсом

(Coons et al., 1941, 1945; Coons, K aplan, 1950). Именно они впервые получили антитела, меченные флуоресцентным кра­ сителем, и использовали их для идентификации антигена на срезах ткани. Эта работа внесла ясность в некоторые аспек­ ты гистопатологии, изучение которых раньше целиком бази­ ровалось на использовании специальных красителей; при ин­ терпретации результатов таких опытов иногда приходилось полагаться лишь на интуицию. Абсолютная специфичность реакции антиген — антитело дает возможность надежно иден­ тифицировать компоненты ткани, однако некоторые проблемы все еще остаются нерешенными, что станет ясно при последу­ ющем изложении.

Первый флуоресцентный краситель, который был исполь­ зован для конъюгации с антителами, — флуоресцеинизоцианат, однако вскоре наиболее широкое распространение полу­ чил флуоресцеинизотиоцианат, что, по-видимому, объясняет­ ся легкостью присоединения его молекул к антителам. При возбуждении соединений флуоресцеина светом с длиной вол­ ны 490 нм наблю дается яркая яблочно-зеленая флуорес­ ценция.

После выхода пионерской работы Кунса по мере улучш е­ ния качества получаемых препаратов антител к разнообраз­ ным антигенам метод развивался, и область его применения сильно расширилась. Вскоре в руках исследователей появи­

пользоваться ферментные метки, визуализируемые с помощью

дукты реакций, катализируемых этими ферментами, путем специальной обработки можно сделать электроноплотными; иногда для выявления иммуноцитохимических реакций на ультраструктурном уровне используют метки, сами по себе являющ иеся электроноплотными, например ферритин (Singer, Schick, 1961) или коллоидное золото (Faulk Taylor, 1971).

Разработана методика мечения антител радиоактивными эле­ ментами; в этом случае взаимодействие с антигеном регист­ рируют при помощи радиоавтографии. Описаны способы при­ соединения к антителам таких меток, которые можно разли ­ чить в сканирующий электронный микроскоп (например, ча­ стицы латекса).

щие избегать конъюгации метки с антителами, что нередко ведет к их инактивации. Существуют методы, основанные на использовании в качестве метки второго антигена (гаптена), который выявляют при помощи вторых антител; высокое сродство биотина к авидину послужило основой технического приема, позволяющего повысить специфичность и интенсив­ ность реакции, разработаны методы окраш ивания по не­ скольким антигенам одновременно.

В этой брошюре приведены общие сведения о некоторых из этих методических подходов; в приложении можно найти технические детали основных методов. Однако предмет на­ столько широк, что его невозможно охватить в этом не­ большом руководстве, целью которого является лишь знаком ­

(Sternberger, 1979; Bullock, Petrusz, 1982, 1983; Wick et al., 1982; Polak, Van Noorden, 1983).

10 2. Получение антител

ходимости могут быть удалены адсорбцией. Д ля этого к сы­ воротке добавляю т белок, выполнявший функцию носителя, Например бычий сывороточный альбумин. По прошествии определенного срока с момента первичной иммунизации (обычно подкожной) кролику (или морской свинке) делаю т вторичную инъекцию антигена, после этого берут кровь для проверки на присутствие антител. Стандартного протокола иммунизации не существует, каждый случай нужно рассм ат­ ривать индивидуально. Отобранную кровь центрифугируют для осаждения эритроцитов. При этом антитела остаются в плазме, которая, строго говоря, не является сывороткой, так как в ней присутствует фибрин, и все ж е вопреки логике препарат антител принято называть антисывороткой.

2.2. Тестирование

Проверка наличия антител в сыворотке. Антисыворотку можно проверить при помощи ферментного иммуносорбент-

ся использовать для иммуноцитохимии, — окраш ивание заве­ домо «положительной» ткани. Недостатком двух первых ме­ тодов анализа является то, что антисыворотка проверяется на чистом антигене, и нежелательные побочные реакции, в ко­ торых могут принимать участие загрязняю щ ие компоненты сыворотки, не выявляются. При иммуноцитохимическом под­ ходе можно сравнить специфическое окраш ивание с фоном, и, если фоновое окрашивание слишком сильное и его не удается ослабить, очевидно, что такую антисыворотку использовать в работе нельзя. Иммуноцитохимическое тестирование пред­

диоактивную метку антигеном за антитела; положение равно­ весия в этой реакции зависит от соотношения меченого и не­ меченого лиганда. Однако следует помнить о том, что «хоро­ ший» по данным радиоиммунологического анализа препарат