2 курс / Гистология / Введение_в_иммуноцитохимию_Полак_Дж_,_Ван_Норден_С_

Рис. 17. Микрофотография среза островковой клетки поджелудочной ж еле­ зы крысы. Д ля локализации инсулина и С-пептида проводили двойное ок­ рашивание с использованием меченных золотом антител. Ультратонкий срез обрабатывали одновременно антителами к инсулину, полученными в мор­ ских свинках, и кроличьими антителами к С-пептиду (для локализации предшественника инсулина). Второй слой представлял собой смесь козьих антител к IgG морской свинки, конъюгированных с частицами золота ди­ аметром 20 нм, и козьих антител к IgG кролика, конъюгированных с час­ тицами золота диаметром 5 нм. Обратите внимание на то, что в области гранул сконцентрированы обе метки. Подготовка ткани: ткань высушивали из замороженного состояния при очень низкой температуре, фиксировали парами тетраокиси осмия и заливали в аралдит. После окрашивания анти­ телами срез докрасили уранилацетатом и цитратом свинца. Ткань была подготовлена д-ром Р. В. Дудеком, Университет штата Северная Каролина, Северная Каролина, США.

ну. Второй слой — биотинилированные козьи антитела к кро­ личьим IgG . Третий слой — комплекс авидина с биотинилированной пероксидазой. При образовании этого комплекса не­ обходимо смешивать компоненты в таком соотношении, что-

бы часть биотин-связывающих участков молекулы авидина была бы не занята биотинилированной пероксидазой и могла бы взаимодействовать с биотином, присоединенным к антите­

очень много молекул пероксидазы. Данный метод можно при­ менять такж е и для электронно-микроскопических исследова­ ний; при этом используют обычный набор электроноплотных меток.

Разработаны методы, позволяющие избежать неж елатель­

тина имеется только один авидин-связывающий участок, и, следовательно, связывание меченного пероксидазой биотинавидинового комплекса с тканью исключается.

6.6. Пектины

Ещ е один метод выявления компонентов ткани основан на применении меченных ферментами, золотом или флуоресцент­ ными красителями лектинов. Строго говоря, его нельзя на­ звать иммуноцитохимическим, так как он не включает ис­ пользование антител. Лектины — это растительные белки, которые связываю тся с тканевыми компонентами, главным образом гликопротеинами с высокой степенью специфичности

(Roth, 1978; Ponder, 1983).

7.СПЕЦИФИЧНОСТЬ РЕАКЦИИ

ИОСНОВНЫЕ КОНТРОЛИ

Д ля того чтобы убедиться в достоверности положительно­ го результата, полученного при помощи иммуноцитохимических методов, необходимо исключить возможность неспеци­ фических реакций (табл. 3 и 4).

Таблица 3. Основные контроли

Контролы на реактивы

1.В каждом эксперименте необходимо проводить окрашивание заведомо положительной ткани

Контроли на специфичность антисыворотки

3. Антитела (в максимальном разведении, дающем хорошее окрашивание) предварительно адсорбируют специфическим антигеном (0,1— 10 нмоль/ /мл)

Результаты окрашивания должны быть отрицательными

4.Антитела в том же разведении, что указано в п. 3, преадсорбируют дру­ гим антигеном

Результаты окрашивания должны быть положительными

5.Антитела в том же разведении, что указано в п. 3, адсорбируют фраг­ ментами специфического или близкого по структуре антигена

Результаты эксперимента помогут установить молекулярную структуру окрашиваемого вещества и выявить фрагменты антигена, с которыми вза­ имодействуют антитела

7.1.Неспецифичность сыворотки

Возможные причины неспецифичности:

1. Гетерогенность популяции антител в сыворотке донора обусловливает взаимодействие не только с исследуемым ан­

генами вместо одного.

7.2.Устранение неспецифичности, возникающей из-за гетерогенности антител

Иммуноадсорбция

Антисыворотку можно очистить путем иммуноадсорбции на специфическом антигене, присоединенном к твердой фазе, например к гранулам сефарозы, с последующей элюцией. Од­ нако необходимо помнить о том, что антитела, пригодные для иммуноцитохимического анализа, должны обладать высокой авидностью и, следовательно, их будет трудно элюировать с сорбента. При такой обработке можно потерять много анти­ тел, и, хотя элюированные антитела будут очень чистыми, авидность их может быть низкой.

Разведение

В результате сильного разведения антисыворотки абсо­ лютное количество загрязняю щ их антител падает, в то время как количество основных специфических антител все еще ос­ тается значительным. Количество загрязняю щ их специфиче­ ски связывающ ихся антител путем разведения может быть снижено до такого уровня, когда ими можно пренебречь.

Адсорбция тканевым порошком, сывороткой или альбумином

Неспецифическое связывание иммуноглобулинов с компо­ нентами ткани за счет гидрофобных или электростатических взаимодействий можно предотвратить путем адсорбции анти­ сыворотки компонентами ткани, такими, как альбумин, или порошком ткани (например, печеночным порошком, высушен­ ным ацетоном) того животного, ткань которого предстоит окраш ивать. Другой метод сводится к предварительной об­ работке ткани альбумином или неиммунной сывороткой ж и ­ вотного, донора вторых антител. При этом блокируется боль­ шинство участков неспецифического связывания, но обра­ зующиеся связи слабее, чем связь антиген — антитело, и по­ этому не мешают первым (специфическим) антителам взаи ­ модействовать с антигеном. К рабочему раствору антител можно такж е добавить нормальную сыворотку до концентра­ ции 1%. Связывание иммуноглобулинов с Fc-рецепторами при окраш ивании фиксированной ткани обычно не наблюдается, однако при исследовании поверхностных антигенов на живых клетках в культуре или в суспензии могут возникать трудно­ сти. Неспецифических реакций такого рода можно избежать, работая с F ab -фрагментами вместо целых молекул иммуно­ глобулинов.

46 7. Специфичность реакции и основные контроли

Адсорбция специфическим антигеном

После адсорбции специфическим антигеном антитела дол­ жны терять способность окраш ивать ткань. Родственные или посторонние антигены не должны связывать антитела и вли­ ять на их активность. Такой контроль необходимо ставить с каждой новой антисывороткой и при обнаружении новых то­ чек взаимодействия антител с тканью . В любом опыте важ но иметь положительный контроль — окраш ивать заведомо по­ ложительную ткань, для того чтобы убедиться в том, что все антитела работаю т нормально.

Удобнее всего проводить адсорбцию на твердофазном им­ муносорбенте (например, на гранулах сефарозы, покрытых антигеном), что позволяет полностью удалить способные к взаимодействию антитела из раствора. При обычной адсорб­ ции в жидкой фазе антитела с низкой авидностью могут вый­ ти из комплекса антиген — антитело и затем связаться с ком­ понентами ткани. Однако на практике такие трудности, ви­ димо, не возникают, так как используемые в иммуноцитохи­ мии антитела должны обладать высокой авидностью, иначе они могут отсоединиться от антигена во время окраш ивания и промывки. Недостаток твердофазных сорбентов в том, что количество вводимого антигена трудно регулировать и, следо­ вательно, трудно сравнивать разные сыворотки между собой. При адсорбции в жидкой фазе количество добавляемого ан­ тигена известно (предпочтительно выразить его в нм оль/м л) и можно сопоставить адсорбцию разных сывороток. Количе­ ство антигена, которое необходимо добавить к антисыворотке, для того чтобы полностью снять окрашивание, можно опре­ делить титрованием. Д ля того чтобы предупредить (за счет конкуренции) неспецифическое связывание антител, присут­ ствующих в разбавленных рабочих растворах в очень не­ больших количествах, со стенками сосуда, в котором предпо­ лагается проводить адсорбцию, к раствору до внесения ан­

пользовать для адсорбции, ограничено. В основе метода ле­ жит конкуренция за антиген между антителами, полученными от животных разных видов. Так, при окраш ивании ткани поч­ ки человека кроличьими антителами к IgG на срез наносят смесь кроличьих и козьих антител к IgG человека, при этом козьи антитела должны быть в избытке. При последующем нанесении на срез козьих антител к IgG кролика или ПАП-

комплекса из кролика специфическое окраш ивание должно быть гораздо слабее, чем при наличии в первом слое только кроличьих антител к IgG человека. Однако самый строгий контроль, конечно, — исчезновение окраски после адсорбции специфическим антигеном.

7.3.Устранение неспецифичности, связанной с перекрестной реакцией

Истинную перекрестную реакцию устранить невозможно. Единственное, что можно посоветовать в этом случае,— по­ пытаться работать с антителами, специфичными к разным частям молекулы, если такие препараты антител имеются.

8.МЕТОДЫ ТЕСТИРОВАНИЯ АНТИТЕЛ И АНАЛИЗА АНТИГЕНОВ IN VITRO

8.1.Ферментный ^ммуносорбентный метод

Строго говоря, этот метод не является иммуноцитохимическим, его применяют для тестирования антител и антигенов in vitro (Voller et al., 1976; O’Beirne, Cooper, 1979).

При тестировании антител, например в первой порции кро­ ви, взятой у 10 иммунизированных кроликов, известное ко­ личество антигена наносят на внутреннюю поверхность ячеек планшетов, используемых для проведения реакции микрогемагглютинации. Вторым слоем служ ат тестируемые антитела в различных разведениях, третий слой — стандартный препа­ рат козьих антител к иммуноглобулинам кролика, конъюги­ рованных со щелочной фосфатазой. Затем фермент проявляют, а окраску оценивают визуально или при помощи колоримет­ ра. Конечно, в каждом эксперименте необходимо ставить по­ ложительные и отрицательные контроли. Вторые антитела можно пометить такж е радиоактивной меткой, а результаты оценивать при помощи сцинтилляционного счетчика.

Метод ELISA менее чувствителен, чем радиоиммунологи-

иммуноцитохимии. Этот метод и менее надежен, ведь количе­ ство пептида, которое сорбируется на пластиковой подложке, непредсказуемо, не ясно такж е, какие части молекулы ока­ жутся доступными антителам. Следует отметить, что этот метод ближе к иммуноцитохимическому анализу, так как ме­ ченым является антитело, а не антиген. В тех случаях, когда нет возможности воспользоваться радиоиммунологическим анализом для проверки антител, выявления перекрестной ре­

Berson, 1959; для знакомства с методом см. Self et al., 1976),

его количестве в экстракте. Следует подчеркнуть, что в этом случае метят не антитела, а антиген; меткой служит какой-

8.3.Методы, основанные на использовании реплик, полученных путем электрофоретического переноса

Для идентификации белковых компонентов ткани, взаи ­ модействующих с антителами, белки тканевого экстракта разделяю т путем электрофореза в полиакриламидном геле. Прямо окраш ивать гель антителами неудобно, поэтому р аз­ деленные белки переносят из геля на нитроцеллюлозную бу­ магу и затем полоску бумаги окраш иваю т антителами с ис­ пользованием ПАП -метода, так, как если бы это был срез ткани. П араллельно соответствующую полоску полиакрила­ мидного геля красят для выявления разделенных белков и

9.ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

Иммунодитохимические методы широко применяются в диагностике различных заболеваний и в исследовательской работе. Благодаря тому, что в настоящее время стало доступ­ ным получение множества чистых препаратов антител, обла­ дающих высокой специфичностью и авидностью, количество научных задач, для решения которых могут использоваться методы иммуноцитохимии, практически не ограничено. Ни­

же приведено несколько примеров.

9.1.Патогистологическая диагностика

Всвязи с тем что в настоящее время множество препара­ тов антител можно приобрести у торговых фирм, а такж е в

результате разработки технологии получения моноклональ­ ных антител иммуноцитохимические методы все шире и шире применяются в диагностике различных заболеваний. Н апри­ мер, лимфомы очень удобно типировать при помощи анти­ тел к тяж елым и легким цепям иммуноглобулинов и моно­

опухолей, что особенно существенно при выяснении происхож ­ дения метастазов. Среди них антитела к тиреоглобулину и кальцитонину при диагностике опухолей щитовидной железы и к щелочной фосф атазе или к антигену из простаты при опухолях простаты. Некоторые полезные в практическом от­ ношении маркеры не специфичны по отношению к какому-то одному типу опухолей, а являю тся общими для ряда ново­ образований и нормальных тканей. Они используются глав­ ным образом в дифференциальной диагностике: например если результаты окраш ивания среза антителами к карциноэмбриональному антигену отрицательны, то можно исклю ­ чить аденокарциному толстой кишки (в том случае, если по­ ставлены все необходимые контроли и ткань правильно под­ готовили и хранили), и, напротив, положительный результат может служить подтверждением диагноза. Окраш ивание ан­ тителами к мембранному антигену эпителия помогает отли­