2 курс / Гистология / Введение_в_иммуноцитохимию_Полак_Дж_,_Ван_Норден_С_

Рис. 19. Срез опухоли поджелудочной железы, секретирующей глюкагон. Окрашен при помощи метода пероксидазы — антипероксидазы. Обратите внимание на зону пролиферации в опухоли, содержащую глюкагон-положи- тельные клетки (отмечены стрелками). Подготовка ткани: ткань фиксиро­ вали раствором Боуина, галивали в парафин; толщина среза — 4 мкм, до­ крашено гематоксилином.

холей эндотелиального происхождения, нейрон-специфическая энолаза маркирует опухоли нервной ткани и эндокринной системы, а глиальный фибриллярный кислый белок — опухо­ ли глии. Тип обнаруживаемых иммуноглобулинов и их лока­ лизация очень важны при диагностике многих заболеваний почек и кожи, для ряда других заболеваний характерно при­ сутствие в кровотоке аутоантител, которые можно обнару­ жить при окрашивании нормальной ткани сывороткой боль­ ного. При помощи специфических антител можно обнаружить и идентифицировать микроорганизмы. Опухоли эндокринной

должны совершенствоваться методы подготовки ткани и по­ лучения специфических препаратов антител.

Будут использоваться и другие неиммунологические ме­ тоды специфической маркировки, возможно в сочетании с иммуноцитохимическими методами. Например, уж е разработа­ ны методы локализации гормонов, меченных радиоактивными

чаях даж е на фиксированных парафиновых срезах (Taylor et al., 1981). Поскольку фиксация и заливка, вероятно, повре­ ждаю т рецепторы (Salih et al., 1979), в дальнейшем методы окраш ивания при помощи антител для изучения антигенов, связанных с рецепторами на поверхности клетки или после

для локализации комплементарной ей информационной РН К , что дает возможность выявить точки синтеза пептида в цито­

подхода с иммуноцитохимическими методами поможет отве­ тить на множество вопросов, касающ ихся локализации мест

двух или нескольких веществ.

10. МИКРОСКОПИЯ

такой длины волны, при которой наблю дается максимальное возбуждение флуоресцентной метки. В тех случаях, когда име­ ется видимый продукт реакции, например при окрашивании пероксидазой, препараты просматривают в обычный микро­ скоп, который может быть снабжен приспособлениями для темного поля, эпиполяризации или дифференциально-интер­ ференционного контраста по Номарскому.

Флуоресценцию принято наблю дать в системе эпииллю ­ минации, когда падающий свет проходит через линзы объек­ тива, который в данном случае функционирует как конден­ сор, и фокусируется на образце. Испускаемый свет проделы­ вает тот ж е путь в обратном направлении к глазу. При этом падающий свет не поглощается предметным стеклом, на ко­ тором леж ит образец. Система эпилюминесценции позволяет следить за флуоресценцией и рассматривать препарат в про­ ходящем свете или при помощи фазово-контрастной оптики; таким образом, одновременно могут быть видны окрашенные и неокрашенные флуоресцентным красителем части образца.

Обычно источником света при работе с иммунофлуоресцентными препаратами служит ртутная или ксеноновая л ам ­ па, а свет, длина волны которого обеспечивает максимальное

и родамин, и флуоресцеин, микроскоп должен быть оснащен двумя наборами фильтров. Красное свечение родамина и зе­ леное свечение флуоресцеина нельзя увидеть одновременно, так как длина волны максимального возбуждения у этих ве­ ществ разная (родамин — 530 нм, флуоресцеин — 495 нм). Если препарат был окрашен по двум антигенам одновремен­ но (например, Т-лимфоциты — родамином, а В-лимфоциты — флуоресцеином), то его сначала нужно просмотреть с одним

а участки ткани, содержащ ие обе метки, окажутся оранж евы ­ ми. Этот метод может потребоваться, например, при провер-

Рис. 20. Срез мозга человека. Видны нормальные астроциты, окрашенные при помощи ПАП-метода антителами к глиальному фибриллярному кисло­ му белку (Л). Обратите внимание на усиление, которого удается добиться при помощи интерференционно-контрастной оптической системы Номарского (В). Подготовка ткани: ткань фиксировали формалином и заливали в парафин. Срез (6 мкм) до окрашивания был обработан трипсином. Д окра­ шено гематоксилином.

ке сыворотки на присутствие аутоантител к клеткам, проду­ цирующим гастрин; при этом проводят окраш ивание среза стенки кишечника исследуемой сывороткой и антителами к гастрину (Scherbaum et al., 1983), или для того, чтобы от­ личить одну популяцию клеток от другой (Valnes, B randtzaeg, 1982).

При работе с пероксидазой, щелочной фосфатазой, други­ ми ферментными метками или с коллоидным золотом продукт реакции можно наблю дать в обычный микроскоп в проходя­ щем свете. Н а многих препаратах слабоокрашенные или очень тонкие структуры, например нервные волокна, лучше видны, если при просмотре используют дифференциально-интерфе­ ренционный метод Номарского, так как в этом случае изо­ бражение рельефно и окрашенные участки образуют выпук­ лости и вогнутости на плоском фоне (рис. 20).

Если в качестве метки при работе на световом уровне ис­ пользуют коллоидное золото или серебро, то интенсивность окраски, особенно на тонких (1 мкм) срезах при нормальной системе освещения, может быть довольно низкой. С помощью темного поля можно добиться эффекта усиления за счет от­ раж ения света частицами металла; в этом случае объект светится. Еще большее усиление обеспечивает эпиполяриза­ ция (D eM ey, 1983b).

Фотографировать препараты нужно только на подходящую для этого пленку. Kodak техническую пан 2415 используют

56 10. Микроскопия

для получения высококонтрастных черно-белых снимков. Д ля флуоресценции хороши пленки, требующие короткой экспо­ зиции, так как интенсивность свечения очень быстро убывает под воздействием ультрафиолетовых лучей. Ilford FP4 и Н Р5 больше всего подходят для получения черно-белых фотогра­ фий флуоресцентных препаратов, a E klachrom 400 — для цветных, однако ы.ам удалось при работе с флуоресцеином по­ лучить хорошие результаты и на пленке Kodachrom 64, тре­ бующей гораздо более длительной экспозиции.

Новую пленку A gfachrom 200 профессиональную исполь­ зуют как для получения фотографий образца в проходящем свете, устанавливая чувствительность 600 ASA, так и для фо­ тографирования флуоресценции при 1000 ASA. При фотогра­ фировании образца в проходящем свете с освещением воль­

проявляют стандартно, считая чувствительность равной 200 ASA (Cole, Polak, 1984).

Н едостаток флуоресцентных препаратов в том, что они не могут длительно храниться и их необходимо сфотографиро­

(2-2-2)-октана (Johnson et al., 1982). При большом увеличе­ нии используются объективы, требующие водной или глице­ риновой иммерсии.

Приложение 59

окраски следят в микроскоп, обычно достаточно пяти минут инкубации при комнатной температуре.

11.Промойте срезы водой.

12.Окрасьте ядра гематоксилином (слабо) или метиловым зеленым.

13.Проведите обезвоживание, заключите срезы.

Криостатные срезы

Окраш ивание ведется так, как описано выше, методы под­ готовки срезов см. в разд. П.З.

П.2. Метод пероксидазы—антипероксидазы (ПАП)

да ), инкубируйте 30 мин.

11.Три раза промойте ЗФ Ф Р.

12.Проявите пероксидазу так же, как в случае использова­ ния непрямого иммунопероксидазного метода.

13.Проведите окраш ивание ядер, обезвоживание, заклю чите срез.

П.З. Криостатные срезы

Такие срезы обычно используют при исследовании поверх­

10 мин при комнатной температуре или при 4°С. Промывают ЗФ Ф Р. Окраш ивают антителами (см. рис. 1).

2. Срезы высушивают при комнатной температуре, заворачи­ вают в липкую пленку или в фольгу и хранят до момента использования при — 20°С. Н агреваю т до комнатной темпера­ туры не разворачивая, затем фиксируют ацетоном или спир­