2 курс / Гистология / Введение_в_иммуноцитохимию_Полак_Дж_,_Ван_Норден_С_

12 2. Получение антител

его антигенность, и шансы получить хороший препарат ан­ тител к фрагменту пептида невелики. Кроме того, чем короче аминокислотная последовательность, тем выше вероятность того, что она будет встречаться в нескольких различных пеп­ тидах. Таким образом, при иммуноцитохимическом анализе распределения пептидов очень часто приходится использовать антитела к различным участкам молекулы, например к N- концу, средней части и С-концевому фрагменту. Только в ре­ зультате окраш ивания таким набором антител можно с уве­ ренностью утверждать, что локализован действительно ис­ следуемый пептид или, напротив, получены сведения о рас­ пределении родственной, но не идентичной молекулы (Larsson, 1980).

2.4. Моноклональные антитела

(клетки, синтезирующие антитела) сливают с культивируемы­

один тип антител, поэтому в результате клонирования удает­ ся получить клеточную линию, секретирующую одинаковые антитела. Отбор нужных клонов производят, анализируя культуральные жидкости на присутствие антител при помощи радиоиммунологического метода, ELISA или иммуноцитохи­ мии. Таким способом удается отобрать моноклональные ан­ титела, узнающие отдельные участки молекулы, а поскольку

получение стандартного препарата антител для длительной работы. Смесь моноклональных антител, направленных к р аз­ ным участкам молекулы, может служить надежным иммуно­ красителем.

М оноклональные антитела используют не только в тех случаях, когда требуются чистые антитела к известному анти­ гену; иногда получают моноклональные антитела к неизвест­ ным антигенам, которые могут служить маркерами определен­ ных типов клеток или внутриклеточных компонентов. Так, на­ пример, были проведены опыты, в которых мышей иммуни­ зировали тимоцитами человека, и в результате клонирования

Рис. 1. Срез миндалины человека. Окрашивание проводили при помощи не­ прямого иммунопероксидазного метода с использованием моноклональных антител к мембранам Т-лимфоцитов и конъюгированных с пероксидазой кроличьих антител к IgG мыши. Препарат докрашен гематоксилином. Об­ ратите внимание на то, что Т-клетки сосредоточены главным образом на периферии, в центре фолликула клеток немного. На вставке видно, что ан­ титела действительно взаимодействуют с мембраной. Подготовка ткани: криостатный срез (4 мкм ), тщательно высушенный на воздухе, фиксировали 10 мин 100% этанолом при 4°С, затем перенесли в забуференный фосфатом физиологический раствор и в дальнейшем не осушали.

был получен набор антител к Т-лимфоцитам человека. Эти антитела используют для иммуноцитохимического разделения клеток, принадлежащ их к различным типам (K ung et al., 1979). Антитела узнают какие-то компоненты клеточной мем­ браны, однако химическая природа антигенов неизвестна

(рис. 1 ).

М оноклональные антитела, полученные в результате им­ мунизации мышей гомогенатом мозга крысы, оказались чрез­ вычайно полезными при исследовании взаимоотношений м еж ­ ду различными группами клеток мозга (S ternberger, 1983).

Разработка методов получения моноклональных антител имела поистине революционное значение для иммуноцитохи­ мии. Можно с уверенностью утверждать, что при помощи моноклональных; антител в клеточной биологии будет сделано еще много открытий.

14 2. Получение антител

2.5. Свойства «хороших» антител

Основное требование, предъявляемое к антителам, — вы­ сокое сродство к антигену; иными словами, узнающие участ­ ки молекулы антитела должны быть хорошо «подогнаны» к

смываться. Однако при работе с гистологическими срезами поврежденной или разрушенной ткани, т. е. с материалом, обычным для патогистолога, или с клетками в мазках следует проявлять осторожность, так как эти препараты неспецифи­ чески сорбируют антитела. В этих случаях, как впрочем и всегда, необходимы очень строгие контроли.

Очень важен такж е титр, или концентрация, антител. При

взаимодействуют практически только со специфическим анти­ геном и побочные реакции несущественны. Тем не менее и в этом случае сильное разведение антител ведет к удалению из

ж ает шумы, возникающие из-за избыточной радиоактивности. Ещ е одно преимущество работы с высоким разведением — возможность наиболее полно использовать имеющееся коли­ чество проверенных, пригодных для работы антител, которые, кстати, довольно дороги. К сожалению , пока мы не знаем надежных способов получения препаратов антител с высокой авидностью и титром.

В тех случаях, когда ведется работа с моноклональными антителами, фактор разведения не так важен, так как в прин­ ципе можно получить неограниченное количество антител, и побочных реакций практически нет.

3.УСЛОВИЯ, НЕОБХОДИМЫЕ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Условия, необходимые для проведения иммуноцитохимического анализа, перечислены в табл. 1 .

Таблица 1. Факторы, существенные для иммуноцитохимического анализа

1. Сохранность антигена (см. табл. 2)

2.Специфичность окрашивания (см. табл. 4, разд. 7)

3.Хорошо охарактеризованный препарат антител

4.Удобная метка

3.1.Нерастворимый, доступный антителам антиген

Для успешного окраш ивания необходимо сделать ткане­ вые антигены нерастворимыми, но при этом антигенные уча­ стки их молекул должны более или менее сохранить свою пространственную структуру и быть доступными антителами. Помимо этого нужно зафиксировать общую структуру ткани для того, чтобы после окраш ивания на препарате можно было идентифицировать иммунореактивную клетку или органеллу.

Раньш е считалось, что хорошая фиксация ткани делает ее не­ проницаемой для антител, так как под воздействием обычных альдегидных фиксаторов образуются множественные попереч­ ные сшивки между тканевыми белками. Однако недавние р а­ боты показали, что при правильной предварительной обра­

с постфиксацией тетраокисью осмия. Эти результаты явля­ ются, по-видимому, следствием улучшения качества препара­ тов антител и доработки некоторых методических деталей. Большинство пептидных гормонов и нейропептидов хорошо сохраняются при высушивании замороженной ткани с после­ дующей обработкой парами слабосшивающих реагентов, т а ­ ких, как формальдегид, я-бензохинон или диэтилпирокарбонат (Pearse, Polak, 1975), однако этот метод не обеспечивает хорошей сохранности ткани, что необходимо для электронной микроскопии. При заливке, когда ткань пропитывается горя­ чим воском или эпоксидной смолой, антигенные детерминан­

i б 3. Условия для проведения иммуноцитохимии

ты ряда пептидов такж е могут пострадать. Многие авторы для световой микроскопии, в частности при выявлении пеп­ тидов в нервной ткани, предпочитают использовать криостатвы е срезы, предварительно фиксированные забуференным формальдегидом или я-бензофиноном путем погружения или

протеолитическими ферментами Перйодат-лизин-параформальдегид; фик­ Иммуноцитохимические исследова­

Недавно было показано, что фиксация пептидов я-бензо- хиноном проходит лучше при повышении температуры до 37°С

и pH до 8,0 (B u’Lock et al., 1982); в этих условиях образует­ ся больше сшивок. Фиксацию формальдегидом такж е можно улучшить, изменив pH раствора. М етод фиксации, предло­ женный для локализации тирозингидроксилазы, растворимо­ го антигена, состоит в следующем (Berod et al., 1981): перфу­ зию формальдегидом проводят при pH 6,5; при этом ф икса­ ция идет очень плохо, но формальдегид быстро проникает в ткань; затем pH резко поднимают до 11, что стимулирует об-* разование сшивок.

При работе с предварительно фиксированными криостатными срезами, препаратами органных и клеточных культур,

С этой целью препарат перед окрашиванием выдерживаю т в

полученных в результате заливки в пластмассу. Н аш опыт под­ сказывает, что необходимости в этом нет, однако присутствие детергента в буфере, используемом для промывки, мож ет препятствовать неспецифической сорбции белков на срезе и таким образом снижать фоновое окрашивание.

Существует и другой подход — ступенчатое обезвож ива­ ние препарата в этаноле, затем в ксилоле с регидратацией не­ посредственно перед окрашиванием. Н едостаток этого метода заклю чается в том, что при таком способе обработки чувстви­ тельные к растворителям антигены могут быть потеряны.

Если ткань, с которой предстоит работать (кишечник или поджелудочная ж елеза), содержит много протеолитических ферментов, то в фиксирующий раствор и буфер для промывки полезно ввести ингибиторы протеаз, например тразилол. Э то может помочь сохранить общую структуру ткани, а такж е некоторые лабильные пептиды, такие, как вазоактивный ин­ тестинальный полипептид.

нат и n -бензохинон; в этих случаях материал (обычно свеж е­ замороженные криостатные срезы) просто фиксируют форма­ лином.

Д ля электронной микроскопии были разработаны методы предварительной заливки и заливки после окраш ивания. Вибратомные или криостатные срезы фиксированного образца можно окрасить антителами и сделать продукт реакции элек­ троноплотным до заливки образца в смолу. Преимущ ество этого метода состоит в том, что, во-первых, антигены не кон­

но найти и отметить хорошо окрашенный участок. Н едостаток

18 3. Условия для проведения иммуноцитохимии

необходимости, поскольку внутриклеточное содержимое и так доступно антителам.

Новейшие методы современного иммуноцитохимического

.анализа на электронно-микроскопическом уровне позволяют использовать ультратонкие срезы замороженной предвари­ тельно фиксированной ткани (Tokuyasu, 1980, 1983). Эти сре­ зы можно окраш ивать^на электронно-микроскопических се­ точках без проводки через растворители и смолы. Метод ис­

фибробластов (W illingham , 1980)— смесь карбодиимида с глутаровым альдегидом (в качестве метки используют ферритин). Свежезамороженные криостатные срезы, фиксирован­ ные спиртом или ацетоном, обычно применяют при изучении поверхностных антигенов лимфоцитов иммуноглобулиновой природы (см. рис„ 1 ). Д ля локализации пептидов эти методы применяются редко.

Выбор метода фиксации определяется спецификой конкрет­ ной реакции антиген — антитело и предполагаемой локализа­ цией антигена. В тех случаях, когда фиксацию ведут погру­ жением в раствор или парами фиксатора после высушивания

представляет собой не вполне понятный, но важный в практи­ ческом отношении способ выявления «крепко сшитых» при

ются сшивки, образованные фиксатором; при этом освобож ­ даются антигенные участки. Некоторые антигены при инку­ бации с ферментом разруш аю тся, большие белковые молеку­ лы (например, предшественники биологически активных пеп­ тидов) могут расщепиться на фрагменты, и, если при этом экспонируются антигенные участки, маскированные в пред­ шественнике, можно получить ошибочную положительную реакцию. Учитывая возможные артефакты, мы рекомендуем проводить обработку протеазами в тех случаях, когда пред­ варительное окраш ивание антителами оказалось слишком

Рис. 2. Срез двенадцатиперстной кишки человека. Окрашивание на родст­ венный фактору V III белок, маркер эндотелиальных клеток, проводили при помощи системы пероксидаза — антипероксидаза с использованием кро­ личьих антител к фактору V III, козьих антител к IgG кролика и кроличье­ го ПАП-комплекса. Л. Срез окрашивали без обработки трипсином. Б. Срез прилежащего участка ткани, окрашенный после 30 мин обработки 0,1%-ным

интенсивно. Докрашено гематоксилином. Подготовка ткани: ткань фикси­

слабым (рис. 2). Этот вопрос обсуждается в работе Финли и Петруц (Finley, Petrusz, 1982). Конкретные детали см. в разд. П .5.

Обработка окислителями

успехом применяют для иммуноцитохимических исследований ка электронно-микроскопическом уровне. Ультратонкие срезы ткани, фиксированной глутаральдегидом и осмием, иногда об­