2 курс / Гистология / Введение_в_иммуноцитохимию_Полак_Дж_,_Ван_Норден_С_

реакцию по желанию можно остановить. Необходимо конт­ ролировать соотношение количества флуоресцентной или ферментной метки с количеством антител при конъюгации. Избыток метки может повлиять на активность антител; несвязавш ую ся метку необходимо удалить до использования антител путем диализа или колоночной хроматографии. Все молекулы антител должны нести метку, так как немеченые

Помимо ферментных методов с использованием немеченых антител было предложено еще несколько способов усиления интенсивности окраски при пероксидазной реакции. Эти ме­ тоды основаны либо на повышении чувствительности реакции, что позволяет выявлять меньшее количество антигена при той же концентрации антител, либо на повышении специфичности реакции. В этом случае то ж е самое количество антигена уда­ ется выявить при меньшей концентрации антител, что дает

шивания.

Дл я световой микроскопии окраску золотом (см. разд. 6.4) можно усилить при помощи эпиполяризационной оптики (см.

микроскопии, то преимущество коллоидного золота как метки состоит в том, что его частицы лучше видны на фоне докра­ шенного обычными способами препарата, чем продукт перо­

2)реакция с Ф ИТЦ при щелочном pH и правильном соот­ ношении реагента и антител;

3)очистка антител от свободного Ф ИТЦ на колонке с сефадексом G25;

4)разделение меченых и немеченых IgG на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой.

полнительная очистка. При мечении золотом антитела присое­

22 3. Условия для проведения иммуноцитохимии

диняют к частицам золота за счет нековалентной адсорбции. Эти реактивы можно купить. Они, конечно, дороги, однако* их стоимость частично компенсируется экономией времени и:

усилий, которые тратятся на приготовление собственных реа­ гентов.

Все антитела, собственного производства или приобретен­ ные, перед употреблением необходимо оттитровать на заве­ домо положительном материале, для того чтобы найти рабо­ чее разведение, которое зависит такж е и от времени окраш и­ вания. Короткая инкубация (10— 60 мин) требует более высо­ кой концентрации антител, чем длительная (12— 24 ч), и не­ редко приводит к повышению неспецифического связывания,,

24 4. Иммунофлуоресцентные методы

Специфическая реакция антиген—антитело с мечеными

первыми антителами

ч*

" < 3vV

|АГ

!А[

Рис. 3. Прямой метод. А. Первые антитела конъюгированы с флуоресцеиноь® (или с пероксидазой). Неспецифические антитела также оказываются ме­ чеными. Б. Показаны некоторые неспецифические реакции, связанные с возникновением гидрофобных и электростатических взаимодействий между иммуноглобулинами и компонентами ткани, а также реакции загрязняющих антител с антигенами ткани. Путем обработки срезов неконъюгированной неиммунной сывороткой животного, донора антител, или инертным белком, таким, как альбумин, до инкубации с первыми антителами эти реакции можно частично блокировать. В. Метод удобен для окрашивания по двум? антигенам одновременно; в этом случае два препарата первых антител ме­ тят разными метками, например родаминизотиоцианатом и флуоресцеини-

зотиоцианатом (Valnes, B randtzaeg, 1982).

26 Иммунофлуоресцентные методы

1 0 * К-Г4

Рис. 5. Срез желудка крысы. Окрашивание проводили при помощи непря­

к IgG кролика, конъюгированных с флуоресцеином; в мышечной ткани стенки желудка видны нервные волокна, содержащие ВИП. Обратите вни­ мание на типичные расширения. ВИП — пептидный нейропереносчик, сти­ мулирующий секрецию, расширение сосудов и расслабление мышц. Под­ готовка ткани: ткань фиксировали я-бензохиноном; толщина криостатного ср еза — 10 мкм.

Меченые вторые антитела (козьи антитела к JgG кролика)

Немеченые первые антитела (кролика)

В

Рис. 6. Непрямой метод. Некоторые неспецифические реакции (Б) могут быть подавлены (В) путем обработки инертным белком или неконъюгированной неиммунной сывороткой донора вторых антител до инкубации с первыми антителами.

3*

5.ИММУНОФЕРМЕНТНЫЕ МЕТОДЫ

5.1.Антитела, конъюгированные с ферментом,— непрямой метода

П ероксидаза впервые была использована для мечения ан­ тител в 1966 году (N akane, Pierce, 1966) и теперь во многих случаях применяется вместо флуоресцеина. Принцип метода непрямого окраш ивания тот же, но антитела визуализируют при помощи гистохимической реакции на пероксидазу; в ка­ честве субстрата обычно используют диаминобензидин (G ra­ ham, Karnovsky, 1966).

Достоинства метода

Метод дает возможность иметь постоянные препараты, по­

Окрашенные тонкие нервные волокна особенно удобно анали­ зировать при помощи оптической системы Номарского. Пероксидазный метод можно использовать и на ультраструктурном уровне; для этого продукт реакции обрабатываю т тетра­ окисью осмия, что делает осадок электроноплотным.

Недостатки метода

Метод включает две дополнительные стадии и соответст­ венно две промывки, во время которых срез может оторвать­

пероксидазы. Кроме того, известно, что бензидин, производ­ ным которого является диаминобензидин (Д А Б ),— потенци­ альный канцероген (Труды М еждународного общества по изу* чению рака, 1972). Однако следует отметить, что вывод о кан­ церогенное™ бензидина был сделан на основании результа­

изводстве; при этом концентрация его была значительно вы ­ ше той, с которой сталкивается человек, ведущий гистохими­

свидетельствующие о том, что диаминобензидин, образующ ий­ ся при добавлении к бензидину двух аминогрупп, почти не обладает канцерогенными свойствами. Однако все ж е лучше соблюдать осторожность и избегать контакта с диаминобензидином и загрязнения этим веществом лаборатории. П ро­ явление Д А Б лучше проводить всегда в одном и том ж е мес­ те, предпочтительно под тягой; с раствором этого соединения следует работать в перчатках; после окончания работы стек­

ствами, например реагент Хэнкера — Йейтса, я-фенилендиа-

альный канцероген и, следовательно, работая с ним, следует

Кроме того, конечный продукт можно сделать электроноплот­ ным путем обработки тетраокисью осмия.

5.2. Метод пероксидазы — антипероксидазы

мостиков (M ason et al., 1969) и ферментного метода с ис­ пользованием немеченых антител или метода пероксидазы —

комплекс кроличьих антител к пероксидазе, связанных с пероксидазой. ПАП -комплекс, образующий третий слой и со­ стоящий из кроличьих 7 -глобулинов и пероксидазы, служит антигеном для немеченых козьих антител к 7 -глобулинам кролика, формирующих второй слой. Козьи антитела к 7 -гло­ булинам кролика должны быть в избытке по отношению к