6 курс / Гастроэнтерология / Российский_журнал_гастроэнтерологии,_гепатологии,_колопроктологии (38)

Более 90% злокачественных новообразований толстой кишки являются аденокарциномами и на сегодняшний день онкогенез аденома – аденокарцинома является хорошо изученной моделью [10]. В общей популяции с возрастом частота обнаружения аденом тол­ стой кишки увеличивается: после 50 лет они определяются у каждого четвертого, а после 80 лет

– у каждого второго [1]. Только 10% аденом трансформируется в рак [9, 15], в большинстве же случаев в течение жизни человека злокачественного перерождения не наступает.

Для выбора тактики в отношении пациентов с аденомами толстой кишки и прогнозирования возможности малигниза-

ции используется комплексная оценка таких факторов риска, как размер, гистологическая структура и степень дисплазии эпителия новообразования [4]. Известно, что увеличение размера аденомы, доли ворсинчатого компонента, выраженности дисплазии служат показателями повышенного риска возникновения рака [1]. Однако в настоящее время определение гистологического строения и дисплазии эпителия показывает низкую и умеренную диагностическую ценность при исследовании патоморфологами, специализирующимися в гастроэнтерологии, и крайне низкую – при исследовании патоморфологами общелечебной сети [7, 22, 24]. Связано это со значительной

долей субъективизма в оценке патогистологического процесса.

Районы ядрышковых организаторов – это участки пяти

с которых в ядрышке происходит транскрипция рРНК [8]. Возможность визуализации аргирофильных белков, ассоциированных с районами ядрышковых организаторов (Ag-ЯОР-белков) – нуклеолина, нуматрина, фибриллярина

– с применением азотнокислого серебра позволяет во всех фазах клеточного цикла интегрально оценивать пролиферативную активность тканей, в то время как с помощью большинства известных маркеров пролиферации оцениваются клетки только

а б

в г

Рис. 1. Аргирофильные белки, ассоциированные с районами ядрышковых организаторов в ядрах клеток слизистой оболочки и опухолях толстой кишки. На светло-желтом фоне клеточных ядер определяются ядрышки (от светлодо темно-коричневого цвета), содержащие черные гранулы серебра (соответствующие Ag-ЯОР-белкам) округлой или овальной формы. Окраска азотнокислым серебром, увеличение ×1000. а – нижние 2/3 крипт (пролиферативный компартмент) патологически неизмененной слизистой оболочки. Небольшое количество гранул серебра в ядрах клеток, ядрышки округлой формы, в большинстве из них 1–3 гранулы серебра.

б – тубулярная аденома маленького размера с дисплазией легкой степени. Небольшое количество гранул серебра в ядрах клеток, ядрышки увеличены в размерах с незначительным полиморфизмом.

в – тубулярно-ворсинчатая аденома большого размера с дисплазией выраженной степени. В ядрах клеток большое содержание гранул серебра, появляются единичные внеядрышковые гранулы, ядрышки с незначительным полиморфизмом строения.

г – высокодифференцированная аденокарцинома. В ядрах клеток очень много гранул серебра, в том числе внеядрышковой локализации, ядрышки крайне полиморфного строения

количество гранул серебра в ядре, в случае краевого слияния близлежащих гранул количество вычисляли путем сравнения площадей прилежащих гранул. На срезах толщиной 4 мкм, окрашенных гематоксилином и эозином, определяли степень выраженности дисплазии эпителия и гистологическое строение аденом [11]. Поскольку в большинстве аденом среднего и большого размера выраженность дисплазии имела очаговый характер, степень последней определяли по максимальной выраженности: в тубулярных аденомах – это зона поверхно­ стных отделов желез и поверхностный эпителий, в тубуляр- но-ворсинчатых – ворсинчатые структуры. При исследовании слизистой оболочки для анализа выбирали только продольно рассеченные крипты с четко определяемым просветом.

Статистический анализ осуществляли в программе

Statistica 6.0. Так как полу-

ченные данные в выборках не соответствовали критериям нормального распределения (критерий Шапиро–Уилка W=0,89, р<0,01), меру центральной тенденции в группах представляли

ввиде медианы (Ме), а меру рассеяния – в виде интерквартильного интервала (и.и.). При проверке статистических гипотез применяли непараметрические методы: однофакторный тест Краскела–Уоллиса, U-тест Манна–Уитни, коэффициент корреляции рангов Спирмена (r). Достоверность критериев оценивали при р<0,05.

Данные о содержании Ag- ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток и результаты сравнения в исследованных группах представлены в таблице. Содержание Ag-ЯОР-белков

вядрах дифференцированных клеток поверхностного эпителия (находящихся в G1/G0-фазе клеточного цикла) и пролифе-

рирующих клеток в нижних 2/3 крипт (находящихся преимущественно в S- и G2/M-фазе

клеточного цикла) существенно отличалось. Это подтверждает факт, что количество Ag-ЯОР- белков (число активных фибриллярных центров) в ядрах клеток зависит от фазы клеточного цикла и, следовательно, отражает как пролиферативную активность, так и плоидность ткани. Аналогичные результаты получены и другими авторами при исследовании слизистой оболочки толстой кишки [12, 21].

Значительные статистические отличия в содержании Ag-ЯОР- белков найдены в аденомах толстой кишки при сравнении легкой и умеренной, умеренной и выраженной дисплазии. Однако при сопоставлении аденом разных размеров (небольшие, средние и большие) и с разным гистологическим типом строения (тубулярные и тубу- лярно-ворсинчатые) статистически значимых отличий между этими группами не наблюдалось (см. таблицу). Содержание Ag- ЯОР-белков в аденомах имело сильную положительную корреляцию со степенью выраженности дисплазии эпителия (r=0,92; р<0,0001), в то время как с раз-

мером (r=0,19; р=0,19) и гисто-

логическим строением (r=0,14; р=0,34) достоверно значимая корреляция отсутствовала. Количества Ag-ЯОР-белков в ядрах клеток пролиферативного компартмента крипт (рис. 1а) и в очагах легкой дисплазии аденом достоверно отличались (р=0,09), кроме тубулярных аденом небольшого размера (рис. 1б). Это согласуется с гипотезой начальных этапов морфогенеза аденом толстой кишки в результате расширения (смещения) зоны пролиферативного компартмента крипт.

Выявленная нами зависимость количества Ag-ЯОР-бел- ков в ядрах клеток только от тяжести предраковых изменений (дисплазии) позволяет оценивать биологический потенциал аденом независимо от их гистологической структуры и разме-

зы, аденомы. Отличия в количестве Ag-ЯОР-белков в ряду легкая – умеренная – выраженная дисплазия в аденомах тол­ стой кишки выявлены и другими исследователями. N. Reissen­ weber с соавт., P. Yang с соавт.

находили отличия в количестве Ag-ЯОР-белков между тубулярным и ворсинчатым секторами аденом [18, 20]. Однако в этих работах указано, что в ворсинчатом секторе аденом дисплазия была выраженнее, чем в тубулярном, что согласуется с нашими данными о количествен-

ной динамике Ag-ЯОР-белков. Гетерогенность морфологического строения аденом и степени выраженности дисплазии диктует необходимость выбирать для анализа клетки в определенных областях – в верхних отделах желез тубулярных аденом и в ворсинчатых структурах тубу- лярно-ворсинчатых аденом.

Несмотря на то, что центральные тенденции (в выборках с ненормальным распределением – медианы) имели значимые статистические отличия (см. таблицу), при анализе

количественного распределения Ag-ЯОР-белков в изучавшихся группах отмечали зону перекрывания между смежными группами, кроме групп умеренной и тяжелой дисплазии. Анализ количественного распределения Ag-ЯОР-белков в исследованных группах (рис. 2) и клетках (рис. 3) показал тесную взаимосвязь между легкой и умеренной дисплазией и значительные отличия между умеренной и выраженной дисплазией. Это согласуется с точкой зрения ученых о практической значи-

мости выделения двух степеней дисплазии – легкой (объединяя в одну группу легкую и умеренную) и тяжелой [19].

Таким образом, количественный анализ Ag-ЯОР-белков в ядрах клеток имеет ограничения при использовании в качестве диагностического теста при градации дисплазии и разграничении предраковых и раковых изменений в толстой кишке. Кроме того, для статистически достоверного анализа необходим подсчет не менее 100 ядер клеток в каждом случае, что ограничивает применение метода на их небольшом количестве, а тем более при анализе единичных и отдельно взятых клеток. Второе условие – определение меры рассеяния (в выборках с ненормальным распределением

– интерквартильного интервала) как объективного отражения вариабельности исследованной популяции клеток и для сравнения полученной выборки с другими [14].

В нижних 2/3 крипт и очагах легкой дисплазии чаще всего определяли клетки с 6 гранулами серебра, в очагах умеренной дисплазии – с 8, выраженной дисплазии – с 16, в аденокарциномах – с 20–21 гранулами. Анализ количественного распределения Ag-ЯОР-белков в ряду пролиферативный компартмент слизистой оболочки – легкая

Список литературы

1.Аруин Л.И., Капуллер Л.Л.,

Исаков В.А. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника – М.: Триада-Х, 1998.

–С. 342–459.

2.Кошкина Л.И., Нейштадт Э.Л.,

Мамаев Н.Н. Определение активности ядрышковых организаторов при дифференциальной диагностике тяжелой дисплазии и карциномы толстой кишки // Арх. пат. – 1992. – Т. 54, № 2. – С. 30–33.

3.Мамаев Н.Н., Мамаева С.Е.,

Либуркина И.Л. и др. Активность ядрышковых организаторов нормальных и лейкозных клеток костного мозга человека // Цитология.

–1984. – Т. 26, № 1. – С. 46– 51.

дисплазия – умеренная дисплазия – выраженная дисплазия

–рак показал последовательное уплощение и расширение гистограмм вправо за счет увеличение доли клеток с более высоким содержанием Ag-ЯОР- белков (см. рис. 3). Так, в ряду пролиферативный компартмент

–легкая дисплазия – умеренная дисплазия – выраженная дис­ плазия доля клеток с 10 и более гранулами серебра составила соответственно 3, 11, 42 и 80%. Характерны отличия умеренной и выраженной дисплазии по доле клеток с 20 и более гранулами серебра – соответственно 2 и 28%; выраженной дисплазии и высокодифференцированной аденокарциномы по доле клеток с 25 и более гранулами серебра – соответственно 11 и 26%. В очагах легкой и умеренной дисплазии клетки с 25 и более гранулами серебра не встречались. Данные о количественном распределении Ag-ЯОР-белков в ядрах клеток можно использовать в качестве дополнительного дифференциально-диагности- ческого критерия.

Вдоступной литературе мы не встречали исследований Ag-ЯОР-белков в опухолях толстой кишки с применением стандартизированных условий окрашивания [5, 13]. В некоторых источниках [2, 18, 20, 21, 23] приведены низкие количес-

4.Atkin W.S., Saunders В.Р. Surveil­ lance guidelines after removal of colorectal adenomatous polyps // Gut. – 2002. – Vol. 51. – Р. 6–9.

5.Aubele M., Bieterferd S., Derenzi­ ni M. et al. Guidelines of AgNOR quantitation // Zentralbl. Pathol.

–1994. – Vol. 140, N 1. – Р. 107– 108.

6.Church J.M. Clinical significance of small colorectal polyps // Dis. Colon Rectum. – 2004. – Vol. 47, N 4. – P. 481–485.

7.Costantini M., Sciallero S., Gianni­ ni A. et al. Interobserver agreement in the histologic diagnosis of colorectal polyps. the experience of the multicenter adenoma colorectal study (SMAC) // J. Clin. Epidemiol. – 2003. – Vol. 56, N 3.

–Р. 209–214.

твенные значения Ag-ЯОР-бел- ков в опухолях толстой кишки по сравнению с полученными нами результатами. Вследствие этого в отдельных исследованиях не определяли значимые диагностические и прогностические различия между морфологическими стадиями онкогенеза. Согласно нашим данным, количество Ag-ЯОР-белков в ядрах клеток можно считать объективным параметром морфологических изменений эпителия и начала малигнизации в аденомах толстой кишки.

Выводы

1.Количество Ag-ЯОР-бел- ков в ядрах клеток зависит от тяжести дисплазии эпителия и не связано с размером и гистологической структурой аденом.

2.В ряду неизмененная слизистая оболочка толстой кишки (пролиферативный компартмент) – легкая дисплазия

–умеренная дисплазия – выраженная дисплазия – рак получены достоверные различия в количестве Ag-ЯОР-белков в ядрах клеток. Эти данные могут быть использованы для дополнительной объективной дифференциальной диагностики при разграничении диспластических и раковых изменений в толстой кишке.

8.Derenzini M. The AgNORs // Micron. – 2000. – Vol. 31, N 2.

–Р. 117–120.

9.Grassi A., Casale V., Fracasso P. et al. Medium-large polyps of the colon: a contribution for their clinical profile and a proper surveillance // J. Exp. Clin. Cancer

Res. – 1997. – Vol. 16, N 3.

–Р. 313–319.

10.Houlston R.S. What we could do now: molecular pathology of colorec­ tal cancer // Mod. Pathol. – 2001.

–Vol. 54. – Р. 206–214.

11.Jass J., Sobin L. World Health Organisation, histological typing

te F.H. A quantitative study of sil­ ver-stained NORs in different seg-

ments of the normal human colorectal crypt // J. Anat. – 1996.

–Vol. 188, N 3. – P. 521–527.

13.Оfner D., Bаnkfalvi A., Riehe­ mann K. et al. Wet autoclave pretreatment improves the visualization of silver stained nucleolar organizer regions associated proteins (AgNORs) in routinely for- malin-fixed and paraffin-embedded tissues // Mod. Pathol. – 1994.

–Vol. 7. – Р. 946–950.

14.Ofner D., Schmid K.W. Standardi­ zed AgNOR analysis: its usefulness in surgical oncology // Histochem. Cell Biol. – 1996. – Vol. 106, N 2.

–P. 193–196.

15.Patel K., Hoffman N.E. The anatomical distribution of colorectal polyps at colonoscopy // J. Clin. Gastroenterol. – 2001. – Vol. 33, N 3. – Р. 222–225.

16.Pich A., Chiusa L., Margaria E.

Prognostic relevance of AgNORs

in tumor pathology // Micron.

– 2000. – Vol. 31, N 2. – Р. 133– 141.

17. Ploton D., Ménager M., Jeannes­ son P. et al. Improvement in the staining and in the visualization of the argyrophilic proteins of the nucleolar organizer region at the optical level // Histochem. J. – 1986. – Vol. 18, N 1. – Р. 5–14.

18.Reissenweber N., Gualco G., Ardao G. et al. The interrelationship between tubular and papillary sectors of tubulo-villous colorectal adenomas: Comparative morphometric analysis and evaluation of cell proliferation // Hum. Path.

–1998. – Vol. 29, N 5. – Р. 431– 437.

19.Stolte M. The new Vienna classification of epithelial neoplasia of the gastrointestinal tract: advantages and disadvantages // Virchows Arch. – 2003. – Vol. 442, N 2.

–P. 99–106.

20.Sugai T., Nakamura S.I., Haba­ no W. et al. Usefulness of proliferative activity, DNA ploidy pattern and p53 products as diagnostic adjuncts in colorectal adenomas

and intramucosal carcinomas // Pathol. Int. – 1999. – Vol. 49, N 7. – Р. 617–625.

21.Sutherland C.G., McMeekin W.

Nucleolar organiser regions in colonic dysplasia. A preliminary study // Histol. Histopathol. – 1989.

– Vol. 4, N 4 – Р. 457–458.

22.Terry M.B., Neugut A.I., Bos­ tick R.M. et al. Reliability in the classification of advanced colorectal adenomas // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. – 2002. – Vol. 11, N 7 – Р. 660–663.

23.Yang P., Huang G.S., Zhu X.S.

Role of nucleolar organiser regions in differentiating malignant from benign tumours of the colon // J. Clin. Pathol. – 1990. – Vol. 43, N 3 – Р. 235–238.

24.YoonH.,MartinA.,Benamouzig R. et al. Inter-observer agreement on

histological diagnosis of colorectal polyps: the APACC study // Gastroenterol. Clin. Biol. – 2002.

– Vol. 26, N 3. – Р. 220–224.