6 курс / Гастроэнтерология / Марченко_Н_В_Клинико_морфологические_и_психоэмоциональные_взаимосвязи

51

холестазе, необходимый при рециркуляции задерживающейся желчи. При этом имеются данные, что у АМА негативных пациентов с ПБЦ/(АИГ) отмечаются более выраженные повреждения желчных протоков и выше степень фиброза в сравнении с АМА позитивными [51]. Одновременно с поражением желчных протков у пациентов с ПБЦ/(АИГ) обнаруживаются ступенчатые, мостовидные некрозы, «интерфейс» гепатит и мостовидный фиброз, характерные для АИГ.

ПБЦ/(АИГ) прогрессирует быстрее, чем типичный ПБЦ, при этом скорость прогрессирования коррелирует с выраженностью воспалительно-некротических изменений паренхимы печени [56, 322].

Были проведены единичные исследования по выявлению характерных морфологических признаков перекрестного синдрома ПБЦ/(АИГ). Так,

O. Chazouilleres и соавт. в качестве морфологических критериев данного заболевания выделяют сочетание «цветущих» желчных протоков и лимфоцитарных ступенчатых некрозов [80, 193, 312]. Наиболее показательна работа A.W. Lohse 1999 года, где он провел сравнительную оценку биоптатов,

полученных у 60 пациентов с АИГ, ПБЦ и сочетанной патологией по следующим критериям: ступенчатые некрозы, точечные (spotty) некрозы/воспаление,

поражение желчных протоков. При этом у пациентов с ПБЦ/(АИГ) выявлялись ступенчатые некрозы и воспаление достоверно чаще, чем у пациентов с ПБЦ, а

поражение желчных протоков достоверно чаще, чем при АИГ [201].

В недавней работе К.Л. Райхельсон в качестве отличительных параметров ПБЦ/(АИГ) при проведении дифференциальной диагностики были выявлены следующие признаки: в сравнении с АИГ – наличие альтерации билиарного эпителия, «цветущих» желчные протоки и гранулем, в сравнении с ПБЦ – наличие обширных ступенчатых некрозов и фолликулоподобных скоплений лимфоцитов в строме портальных трактов, редкое обнаружение признаков внутриклеточного холестаза [22]. Такой признак как формирование гранулем при дифференциальной диагностики АИГ и ПБЦ/(АИГ) также были выявлен в другой отечественной работе [2].

52

Учитывая отсутствие специфических клинических и иммунологических признаков для изучаемых заболеваний, большое значение в постановке диагноза и дифференциальной диагностике имеет морфологическая оценка биоптатов печени. Несмотря на большое количество проводимых исследований, которые позволили выявить характерные морфологические признаки для отдельных АИЗП, в первую очередь моновариантов АИГ и ПБЦ, остается проблема дифференциальной диагностики. Наибольшие трудности в данной ситуации представляет собой диагностика ПБЦ/(АИГ), а также дифференциальная диагностика на начальных и терминальных стадиях между различными вариантами АИЗП.

1.5 Роль фактора некроза опухоли – альфа в патогенезе заболеваний человека

Фактор некроза опухоли (ФНО) — плейотропный (мультифакториальный)

цитокин играющий центральную роль во многих клеточных и биологичеких процессах. В физиологических условиях является иммунорегуляторным медиатором, обеспечивающим энергетический обмен, рост, пролиферацию и дифференцировку клеток, активацию нейтрофилов, Т- и В-лимфоцитов,

направленную миграцию клеток, воспаление, поддержание структуры лимфатической системы, лизис опухолевых и инфицированных бактериями

(такими как, Listeria и M. tuberculosis и др.) и вирусами клетки, а также принимает участие в регуляции апоптоза. В условиях патологического процесса выступает в роли провоспалительного агента, определяет экспрессию адгезивных молекул на эндотелиальных клетках [256, 260, 272].

Семейство ФНО, состоит из 19 лигандов и 29 рецепторов, которые играют очень разнообразные функции в организме. Извстно, что ФНО-α

взаимодействуют с 2 различными рецепторами: рецептор ФНО 1 (TNFR1,

CD120a, 55 кДа) и рецептор ФНО 2 (TNFR2, CD120B, 75 кДа). Существует стандартизированная, принятая международной комиссией номенклатура лигандов (TNFSF) и рецепторов (TNFRSF) семейства ФНО. При этом ФНО-α

имеет код TNFSF2, а его рецепторы TNFR1/2 – TNFRSF1 А/В [40].

53

Впервые термин «опухоль некротизирующий фактор» был использован в

1962 году для обозначения цитокина, индуцирующего некроз опухоли (саркомы

37), выявленного в сыворотке крови мышей, а его свойства были описаны Е.А. Carswell и соавт. в 1975 году [78, 246]. В 1984–1985 г.г. B. B. Aggarwal и

соавт. идентифицировали два структурно различных вещества. Первоначально был очищен белок лимфотоксин-α размером 25кДа, который впоследствии был переименован в ФНО-β. В дальнейшем был выделен второй цитотоксический фактор массой 17 кДа и состоящий из 157 аминокислот, названный ФНО-α. При этом было определено, что ФНО-α вырабатывается преимущественно макрофагами, а ФНО-β лимфоцитами [42]. ФНО-α и ФНО-β были связаны с общим высоко-аффинным к поверхности клеток рецептором, присутствующим на большинстве типов клеток [39]. С этого же времени началась работа по клонированию генов данного цитокина [257].

Показано, что рецептор TNFR1, который содержит домен смерти – DD (death domain), очень разнородный и экспрессируется на всех типах клеток организма, изученных к настоящему времени, что может отражать разнообразные функции рецептора в различных типах клеток. В противоположность этому,

экспрессия TNFR2 ограничена клетками иммунной системы, эндотелиальными и нервными клетками. Кроме того, есть данные, что характер клеточной сигнализации может отличаться между лигандами, экспрессирующимися в виде растворимых белков и в трансмембранной форме [37]. Очевидно, что эффект клеточной сигнализации более ограничен, если лиганд экспрессируется только как трансмембранный белок. ФНО-α экспрессируется в двух формах:

растворимой, обусловливающей патологические эффекты цитокина, и

трансмембранной, определяющей его биологическую активность.

ФНО-α реализует свои свойства различными сигнальными путями,

аутокринным, паракринным, механизмом обратной сигнализации,

непосредственного воздействия на клетку [40, 140]. Феномен «обратной сигнализации» является характерной особенностью некоторых лиганд-

рецепторных взаимодействий и заключается в том, что вместо сигнализации,

54

передаваемой от лиганда к рецептору, она передается от рецептора к клетке,

несущей трансмембранную форму лиганда [328].

Известно, что ФНО-α играет важную роль в поддержании равновесия между

Teffs и Treg лимфоцитами. Широкий спектр иммунопатологических и иммунозащитных эффектов данный цитокин осуществляет посредством своих рецепторов. При этом TNFR1, представленные в организме повсеместно,

преимущественно экспрессируется Teffs клетками, а TNFR2, представленные в большинстве своем на лимфоцитах, преимущественно Treg и в незначительном количестве Teffs клетками. Таким образом, предполагается что стимуляция

TNFR1 предпочтительно активирует Teffs клетки и осуществляет провоспалиетльные, цитотоксические, апоптотические эффекты ФНО-α, а

стимуляция TNFR2 предпочтительно активирует Treg клетки, которые отвечают за подавление активности аутореактивных цитотоксических клеток. ФНО-α

способен стимулировать рост пула Treg клеток, что представляет собой основной момент отрицательной обратной связи, с помощью которой данный цитокин противодействует своим мощным провоспалительным эффектам [203, 276].

ФНО-α индуцирует как минимум 5 различных типов сигналов, включающих в себя активацию NF-kB, активацию путей апоптоз, выделение внеклеточной регулируемой киназы (ERK), р38 митоген-активированной протеинкиназы

(p38MAPK) и с-Jun N-концевой киназы (JNK). Когда ФНО-α связывается с TNFR1

на поверхности клетки-мишени, он мобилизует белок называемый TNFR-

ассоциированный доменом смерти (TRADD) и через активацию каскада каспаз (8, 3) вызывает апоптоз [66, 151]. Также, ФНО-α может активировать митохондрии,

приводя к последовательному выделению активных форм кислорода, цитохрома С и проапоптотического белка Bax, что приводит к активации каспазы-9 и

каспазы-3 и апоптозу клетки [228]. Кроме того было показано, что ФНО-α также активирует NF-kB, который в свою очередь регулирует экспрессию белков,

ассоциированных с жизнеспособностью клеток и клеточной пролиферацией [50].

Активация NF-kB ФНО-α обеспечивается последовательной мобилизацией

TNFR1, TRADD, TNFR-ассоциированного фактора 2 (TRAF2/TRAF5), рецептор

55

взаимодействующего белка (RIP), TGF-β-активированной киназы 1 (TAK1), IκB

киназы (IKK) комплекс, и ингибитора ядерного фактора-κBα (IκBα)

фосфорилирования, убиквитинирования, и деградации, а также ядерной транслокации р50 и р65 и ДНК связывания [105]. Провоспалительные эффекты ФНО-α обеспечиваются за счет NF-kB регулируемых белков, таких как IL-6, IL-8, IL-18, хемокины, индуцированной синтазы оксида азота (iNOS),

циклооксигеназы-2 (СОХ-2) и 5-липоксигеназы (5-LOX) – всех основных медиаторов воспаления. Более того, ФНО-α может индуцировать экспрессию самого себя через активацию NF-κB [37]. ФНО-α также может запускать пролиферацию клеток через активацию фактора транскрипции – активатора протеина-1 (AP-1) [235], который активируется ФНО-α путем последовательной мобилизации TNFR1, TRADD, TRAF2, MAP/ERK киназы 1 (MEKK1), MAP

киназы +7 (MKK7) и JNK. Поскольку TNFR2 может непосредственно связываться с TRAF2, он может активировать как NF-kB, так и МАРК. Также надавно было показано, что TRADD является посредником в клеточной сигнализации на Toll-

подобные рецепторы 3 и 4 [116].

Описанные выше данные показывают, что ФНО-α вовлечен в различные патофизиологические процессы и может выполнять как протективную, так и деструктивную функции в организме. Поскольку данный цитокин вырабатывается различными типами клеток в определенном количестве, это может играть важную роль в сохранении баланса между положительным и отрицательным воздействием цитокина на организм. Для реализации защитной роли ФНО-α в устойчивости к патогенам имеет значение уровень его экспрессии. Нарушение продукции ФНО-α

может оказать отрицательное воздействие на организм. В естественных условиях данный цитокин вырабатывается многими типами клеток (мононуклеарными фагоцитами, В-лимфоцитами, Т-лимфоцитами, естественными киллерными клетками, полиморфноядерными лейкоцитами, тучными клетками и базофилами,

фибробластами, клетками эндотелия сосудов) [131, 281], и ограничение выработки ФНО-α одним типом клеток может приводить к нарушению баланса между его позитивными и негативными воздействиями.

56

На данный момент установлена четкая взаимосвязь ФНО-α с развитием некоторых системных аутоиммунных и воспалительных заболеваний, таких как:

ревматоидный артрит [121], аутоиммунные демиелинизирующие заболевания

[176] и воспалительные заболевания кишечника [24, 28]. Показано, что гиперпродукция этого цитокина лежит в основе хронизации иммунопатологического процесса. В результате, при данных заболеваниях было обосновано применение препаратов ингибиторов ФНО-α, которые в дальнейшем показали хорошие результаты в лечении пациентов с ревматоидным артритом

[122], болезнью Крона [252] и спондилопатией [60]. В тоже время, системное снижение продукции цитокина может привести к нежелательным побочным эффектам со стороны иммунной системы. Так, описаны случаи реактивации туберкулезной инфекции на фоне антицитокиновой терапии [226].

Имеются данные, подтверждающие роль ФНО-α в патогенезе поражения печени различной этиологии: хроническиом вирусном гепатите В и С [1, 111],

алкогольном гепатите [162, 164], холестазе различной этиологии [164, 167, 249].

Интересно, что при исследовании ФНО-α у пациентов с вирусными гепатитами,

уровень его был выше у пациентов, имеющих аутоантитела к антигенам печени

(ASMA, АМА, ANA, анти-LKM-1) в сыворотке крови [1].

Таким образом, к настоящему времени имеется большое колическтво исследований, показавших роль ФНО-α в различных заболеваниях человека. При этом мало изучено место данного цитокина в запуске и поддержании аутоиммунных процессов в печени.

1.5.1 Современные представления о роли фактора некроза опухоли – альфа в развитии аутоиммунного гепатита

В последние годы стали появляться данные о роли ФНО-α в развитии АИЗП. ФНО-α активирует специфические внутриклеточные пути в гепатоцитах,

которые по-разному влияют на клетку, такие как проапоптотические сигналы через каскад каспаз, а также через активацию путей ядерного фактора NF-кВ

[305]. В исследовании К. Streetz и соавт. на пациентах и мышиных моделях было

57

установлено что ФНО-α вовлечен в индукцию повреждения паренхимы печени в качестве запускающего агента. При этом было показано, что соотношение сывороточного уровня ФНО-α к его рецепторам было выше у пациентов с фульминантной печеночной недостаточностью и уровень цитокина в сыворотке крови напрямую коррелировал с тяжестью заболевания [301]. Ключевая роль ФНО-α в повреждении печени была показана на экспериментальных мышиных моделях, которые позволяют изучить роль отдельных компонентов иммунного ответа. S. I. Grivennikov и соавт. на моделях мышей показали, что в развитии аутоиммунного поражения печени участвует как ФНО-α, вырабатываемый Т-клетками, так и ФНО-α, вырабатываемый макрофагами [137].

Японские ученые на мышиных моделях подтвердили роль ФНО-α в запуске патологических процессов АИГ через экспрессию хемокина ССL20 в гепатоцитах.

Было показано, что назначение анти ФНО-α препаратов препятствовало развитию аутоиммунного гепатита, при этом терапия анти ФНО-α не подавляло аутоиммунный процесс после его развития [160]. В последние годы все чаще поднимается вопрос о возможной роли препаратов биологической терапии, в том числе и анти-ФНО-α в развитии АИГ [114]. В литературе имеются данные о стимуляции развития АИГ на фоне применения биологической терапии – анти-

ФНО-α препаратами такими как инфликсимаб, этанерцепт, адалимумаб. При этом опубликованы как отдельные случаи [117, 139, 258], так и данные мета-анализов

[71, 134] В тоже время имеются описания единичных случаев улучшения течения АИГ на фоне проведения антицитокиновой терапии по поводу сопутствующей аутоиммунной патологии [115, 315, 331]. Так, С. Weiler-Normann и соавт. недавно представили данные по успешному лечению АИГ у 11 пациентов не отвечающих на иммуносупрессию. На фоне терапии инфликсимабом отмечалось снижение уровней АСТ и IgG [329].

Имеются единичные исследования по оценке уровня самого цитокина ФНО-

α в сыворотке крови пациентов с АИГ. G. Maggiore и соавт. показали, что уровень ФНО-α в крови пациентов с АИГ 1 типа достоверно выше, чем у здоровых пациентов в состоянии ремиссии. При этом не было выявлено корреляции с

58

уровнем АЛТ, γ-глобулинами [211]. Похожие результаты показало исследование М. Durazzo и соавт. – выявлялись более высокие уровни ФНО-α в крови пациентов с АИГ в сравнении со здоровыми людьми и пациентами с НАЖБП.

При этом сывороточные уровни ФНО-α положительно коррелировали с уровнем АЛТ [112]. В литературе не найдено данных об определении уровня экспрессии ФНО- α в ткани печени пациентов с АИГ.

Достаточно большое количество исследований направлено на выявление взаимосвязи между полиморфизмом гена ФНО-α и развитием АИГ. Несколько полиморфизмов наблюдаются в промотерном регионе данного гена, наиболее значимыми из которых для аутоиммунных заболеваний являются -308 и -238 [24, 28]. В позиции -308 описывают два варианта полиморфизма: -308G (TNF1) и

редкая аллель -308A (TNF2). Генетические исследования показали, что TNF2

лежит в той же области (регионе), что и характерный для АИГ

HLA-A1-B8-DR3-DR2 гаплотип [86, 332]. Лица с гаплотипом -308A продуцируют высокие уровни ФНО-α и более восприимчивы к различным аутоиммунным заболеваниям, а по некоторым данным и к аутоиммунному гепатиту [70, 86, 94, 120, 309]

Получены противоречивые результаты по восприимчивости к АИГ у пациентов-носителей аллели -308A в разных когортах. Наличие данной аллели взаимосвязано с развитием АИГ у европейских пациентов и европеоидных североамериканцев [86, 94], но подобная ассоциация не была выявлена в Бразилии [70], а данные по китайской популяции противоречивы: Х. Ма и соавт.

выявили взаимосвязь между аллелем -308А и развитием АИГ [207], в то время как

L.Y. Fan и соавт. не обнаружили такой связи ни с развитием АИГ, ни с ПБЦ [120].

Также, не было выявлено взаимосвязи развития АИГ и аллелью -308А в японской популяции [338]. A.J. Czaja и соавт. в своем исследовании показал, что пациенты-

носители аллели -308А склонны к раннему дебюту заболевания, хуже достигают ремиссии и чаще формируют цирроз печени [94].

Таким образом, имеющиеся в литературе данные о роли ФНО-α в развитии АИГ скудны и противоречивы. Наибольшее количество работ направлено на

59

изучение полиморфизма гена ФНО-α, в то время как исследований экспрессии данного цитокина в ткани печени не проводилось.

1.5.2 Современные представления о роли фактора некроза опухоли – альфа в развитии первичного билиарного цирроза

Отдельно обсуждается роль ФНО-α в развитии ПБЦ. В 1990 г. А. Jones и

соавт. описали возникновение желтухи и холестаза на фоне назначения экзогенного ФНО-α онкологическим пациентам в качестве возможного противоопухолевого агента. Они предположили, что производство собственного ФНО-α мононуклеарами может способствовать развитию холестаза при ПБЦ

[167]. В 2003 г. японские ученые на мышиных моделях установили, что ФНО-α

нарушает барьерную функцию холангиоцитов без выраженных структурных изменений самих клеток и данные нарушения приводят к утечке компонентов желчи при первичном билиарном циррозе [138]. Было показано, что клетки билиарного эпителия гиперэкспрессируют ФНО-α и его рецепторы, тем самым подтверждается теория о паракринной активности и влиянию на эти клетки, что приводит к их пролиферации и, потенциально, к апоптозу [304].

Имеющиеся в литературе данные по оценке уровня ФНО-α в сыворотке крови немногочисленны и противоречивы. Показано, что у пациентов с ПБЦ уровень цитокина выше, чем у здоровых людей [14, 31, 170, 325], но ниже в сравнении с пациентами с ПБЦ/(АИГ) [31]. В исследовании 1998 г. японских авторов выявлено, что уровень ФНО-α в сыворотке крови пациентов с ПБЦ не превышал допустимых значений, однако отмечалась тенденция к его снижению у пациенток старше 30 лет [336]. Не найдено различий в уровне ФНО-α в сыворотке крови у пациентов с ПБЦ и пациентами с другими неаутоиммунными заболеваниями печени. При этом экспрессия рецепторов к ФНО-α был выше у пациентов с ПБЦ, а корреляции меду уровнем ФНО-α и его рецепторами выявлено не было [325].

Противоречивы данные по взаимосвязи уровня ФНО-α и гистологической стадией ПБЦ. В исследовании S. Kakuma и соавт. не было выявлено корреляции с

60

гистологической картиной [170], в то время как более позднее исследование

M. Neuman и соавт. показало более высокий уровень цитокина у пациентов с IIIIV стадией ПБЦ в сравнении с I-II [237]. Имеются единичные данные по оценке экспрессии ФНО-α мононуклеарными фагоцитами печени, которые также подтверждают роль ФНО-α в развитие аутоиммунных заболеваний печени.

M.J. Hussain и соавт. показали более высокий уровень экспрессии цитокина в криообразцах пациентов с АИЗП в сравнении с пациентами с неалкогольной жировой болезнью печени [155]. Исследование немецких ученых по оценке экспрессии ФНО-α и CD68 макрофагов в замороженных биоптатах печени 111

пациентов с хроническими заболеваниями печени различной этиологии,

включающих 27 с АИГ и ПБЦ, не выявило отличия уровней ФНО-α в различных группах [343].

Результаты исследований по выявлению взаимосвязи полиморфизма гена ФНО-α с развитием ПБЦ противоречивы. М. А. Gordon и соавт. в 1990 г.

продемонстрировали взаимосвязь носительства аллели -308А с более редкой встречаемостью ПБЦ в сравнении с группой контроля [133]. Однако дальнейшие исследования D. E. Jones и соавт. не выявили какой-либо взаимосвязи в предрасположенности к развитию ПБЦ и аллелями -308А и -238А [168]. В другом исследовании тяжесть заболевания также ассоциировалась с выявлением аллели -

308А [308]. Результаты исследования J. E. Jeng и соавт. показали взамосвязь носительства аллели -308А не только с тяжестью заболевания и степенью фиброза печени, но и более высоким риском развития ГЦК [163]. В более поздних исследованиях ученых не было выявлено ассоциации полиморфизма ФНО-α с

развитием ПБЦ при исследовании китайской и итальянской популяции [120, 240].

В 2012 г. китайские ученые опубликовали данные двух мета-анализов, не выявивших взаимосвязи между полиморфизмами -308 и -238 и риском развития ПБЦ [82, 268].

В литературе имеются единичные случаи описания взаимосвязи антицитокиновой терапии ФНО-α и развитием ПБЦ. В 2008 г. А. Spadaro и соавт.

представили результаты наблюдения пациентки с ревматоидным артритом и