4 курс / Акушерство и гинекология / Цитологический_атлас_Критерии_диагностики_заболеваний_шейки_матки (1)

Зонды представляют собой короткие молекулы ДНК, комплементарные ДНК-мишени (в данном случае, HPV). Метки, выявляемые иммуноцитохимическим методом, позволяют судить о наличии или отсутствии ДНК-мишени (ви­ руса папилломы человека). Этот метод обладает высокой специфичностью и до появления ПЦР был самым высоко­ чувствительным.

Протокол метода гибридизации in situ требует заданного температурного режима. Фирмой ЛабМетод могут быть предложены:

-Водяная баня (№ WB14).

-Термостат (№ INC222).

-Программируемый термостат OmniSlide (№ HB-OS-BB-220) с принадлежностями.

Оценка результатов при использовании светового или флуоресцентного микроскопа по выявлению хромогеновых гранул или флуоресценции.

Автоматические системы для выполнения гибридизации in situ NexES (№ 850-100) с набором реагентов, кото­ рые обеспечивают высокий уровень исследования с положительными и отрицательными контролями.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

ПЦР - метод, в основу которого положен процесс естественной репликации ДНК, осуществляемый в клетках.

ПЦР позволяет обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК среди большого количества других молекул вирусного и клеточного происхождения.

Для проведения ПЦР необходимо наличие в реакционной смеси ряда компонентов:

-ДНК-мишени (ДНК, которую необходимо амплифицировать).

-Праймеров - пар олигонуклеотидов, протяженностью от 15 до 30 нуклеотидных пар (нп), комплементарных к соответствующим участкам ДНК-мишени. Корректно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.

-Taqполимеразы - термостабильного фермента, достраивающего вторую цепь ДНК по одному из тяжей ДНКмишени.

-Дезоксинуклиотидтрифосфатов дНТФ - дезоксиаденозинтрифосфат дАТФ, дезоксигуанозинтрифосфат дГТФ, дезоксицитозинтрифосфат дЦТФ и дезокситимидинтрифосфат дТТФ. Эти компоненты используются Taqполимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

-Буферного раствора (БР), обеспечивающего оптимальные условия для реакции.

ПЦР включает в себя три температурных этапа:

-Первый этап состоит из процесса денатурации ДНК, находящихся в образце, в результате денатурации одна двухцепочечная молекула ДНК переходит в две одноцепочечные молекулы. Температурный режим ТР - 9295 °С.

-Второй этап заключается в гибридизации (присоединении) праймеров к комплементарным участкам ДНКмишени; этот процесс носит название отжига праймеров. ТР - 55-60 °С.

-Третий этап ПЦР включает в себя синтез второй цепи на одноцепочечной молекуле ДНК-мишени, на которой произошел отжиг праймеров. ТР на этом этапе соответствует оптимальным условиям работы Taq-полимера- зы и равен примерно 70-74 °С.

Если трехэтапный температурный цикл многократно повторить (30—40 циклов), то количество амплифицированных молекул ДНК-мишени (ампликонов) достигнет приблизительно 2" (где п число циклов амплификации). Необходимо отметить, что процесс накопления продуктов амплификации идет по геометрической прогрессии лишь определенное число циклов, а затем имеет место эффект «плато», то есть количество ампликонов не возрастает.

Детекцию ампликонов выполняют методами электрофореза или с помощью ДНК-ИФА. В настоящее время на рынке существует система DASH, которая позволяет выявлять ампликоны, используя совершенную систему ДНК-ИФА (дополнительная информация по запросу).

Организация ПЦР лаборатории требует специального оборудования (ламинары, настольные центрифуги, тер­ мостаты, пипетманы и т. д.) и специально оборудованных и корректно расположенных помещений (для предупрежде­ ния контаминации).

Метод in situ RT-PCR был разработан с целью соединения высокой чувствительности метода реакции об­ ратно - транскриптазной полимеразной цепной реакции (RT-PCR) с преимуществами исследований in situ, что особенно важно, например, для вирусов с низким уровнем репликации. Как и ISH. in situ RT-PCR состоит из нескольких этапов: подготовка биологического материала, in situ амплификация, обнаружение внутриклеточньи продуктов RT-PCR.