4 курс / Акушерство и гинекология / Морозова_К_В_Полиморфизм_генов_ферментов_детоксикации,_антиоксидантной

Протективный эффект в отношении

рака простаты.

ГЛАВА 2. Методы исследования. 2.1. Материал и объект исследования.

Клиническое обследование пациенток, включенных в наше исследование, осуществляли на базах кафедры акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета РНИМУ им. Н.И. Пирогова (заведующий кафедрой - заслуженный врач России, д.м.н., профессор О.В. Макаров).

Пациенток в основную группу отбирали среди женщин с 2 и более репродуктивными потерями в анамнезе. Диагноз прерванной беременности был установлен при госпитализации на основе сбора анамнеза, оценки жалоб, а также с применением дополнительных клинико-лабораторных методов обследования, УЗИ органов малого таза. В наше исследование были включены пациентки с установленным диагнозом неполного самопроизвольного выкидыша, самопроизвольного аборта в ходу, либо неразвивающейся беременности на сроке более 7 недель гестации.

Пациенткам с нарушенной беременностью было произведено инструментальное удаление остатков или измененного плодного яйца, в послеоперационном периоде всем без исключения была назначена утеротоническая и антибактериальная терапия.

С целью исключения патологии кариотипа эмбриона как причины потери беременности, в основную группу вошли пациентки со сроком гестации на момент гибели плода более 7 недель по размеру плодного яйца, всем отобранным пациенткам было произведено кариотипирование абортусов. Для исключения спорадических выкидышей критерием включения в группу являлось наличие в анамнезе 2 и более эпизодов

43

невынашивания первой половины беременности. Случаи таких исходно грубых аномалий кариотипа, как анэмбриония были исключены из исследования. В группу не вошли также пациентки с потерей беременности, наступившей в результате ЭКО.

Критерием включения пациенток в контрольную группу являлось наличие у женщин 2 или более беременностей, протекавших без угрозы прерывания и закончившихся нормальными срочными родами. Из исследования были исключены пациентки с эпизодами репродуктивных потерь в анамнезе. Случаи серьезных угроз невынашивания беременности, с наличием кровяных выделений во время беременности также не входили в контрольную группу.

Исходя из задач нашего исследования основную группу составили пациентки с 2 и более репродуктивными потерями первой половины беременности, контрольную группу - женщины с 2 и более родами в анамнезе.

На каждую пациентку нами была заведена индивидуальная карта, куда были занесены данные анамнеза, включающие антропометрические данные, уровень социально-экономического и профессионального статуса, перенесенные гинекологические и экстрагенитальные заболевания, характеристику репродуктивного здоровья, течение и исход беременностей, а также результат проводимого нами генотипирования. Вся информация была объединена в специальную базу данных для проведения статистического анализа полученных результатов.

Пациенткам обеих групп было выполнено полное клиниколабораторное обследование согласно современным медико-экономическим стандартам.

1. При поступлении в стационар или родильный дом всем пациенткам проводили тщательный сбор анамнеза, который включал данные о:

-материальном, социальном и профессиональном статусе

-вредных привычках (прием алкоголя, табакокурение)

44

-воздействию вредных профессиональных факторов (работа с компьютером, контакт с химическими веществами)

-перенесенных соматических заболеваниях, наличию хронической экстрагенитальной патологии, генетически детерминированных заболеваний.

-перенесенных вирусных и бактериальных инфекциях

-менструальной функции (возраст наступления

менархе, продолжительность и регулярность менструального цикла, характер и объем менструальных выделений).

-половой жизни (возраст начала половой жизни, количество половых партнеров, способ контрацепции)

-гинекологических заболеваниях (время возникновения, длительность течения и исход)

- репродуктивной функции (количество, течение, исход беременностей).

2. После сбора анамнеза проводили общее обследование пациенток.

В ходе объективного осмотра были отмечены антропометрические данные, степень выраженности подкожно-жировой клетчатки, состояние кожных покровов и видимых слизистых, определение характера оволосения. С целью дообследования была проведена оценка функции дыхательной и сердечно-сосудистой систем, измерение артериального давления, частоты пульса и дыхания, поверхностная и глубокая пальпация живота, наличие или отсутствие перитонеальных симптомов, перкуссия живота, выявление симптома Пастернацкого, выявление периферических отеков, изменений по ходу сосудистых пучков.

3. Проведение специального гинекологического обследование включало в себя: осмотр наружных половых органов, оценку характера и степени оволосения; осмотр шейки матки и стенок влагалища с помощью зеркал с целью оценки состояния слизистой и характера выделений из цервикального канала; двуручное влагалищное исследование для

45

определения размера, положения и консистенции тела матки, состояния придатков матки.

4. В перечень дополнительных методов исследования, проводимых нашим пациенткам, были включены:

1.Клинический анализ крови

2.Общий анализ мочи

3.Определение группы крови и резус фактора

4.Биохимический анализ крови

5.Коагулограмма

6.Определение гормонального профиля.

7.Анализ крови на определение инфекций RW,ВИЧ, HBS, HCV

8.ЭКГ

9.Бактериоскопия отделяемого влагалища и цервикального канала

10.Посев из цервикального канала на микрофлору и определение чувствительности к антибиотикам.

11.Исследование отделяемого цервикального канала и влагалища с помощтю ПЦР - диагностики на ИППП.

12.Ультразвуковое исследование органов малого таза При проведении УЗИ органов малого таза был использован аппарат

Voluson E8 фирмы GE с применением мультичастотного микроконвексного внутриполостного ректо-вагинального датчика с частотой (4.0 - 11.0 МГц).

Во время исследования нами была проведена оценка состояния органов малого таза, измерение размеров матки, определение ее консистенции и формы, оценивали состояние эндометрия, структуру яичников и маточных труб, оценивали наличие свободной жидкости в полости малого таза. При подтверждении факта беременности проводили измерение размера плодного яйца, КТР (копчико-теменной размер) эмбриона, расположение и состояние хориона. При проведении УЗИ во II-III триместрах определяли размеры

46

гена, отвечающего за обмен катехоламинов COMT, генов репарации ДНК

OGG1.

Специальные генетические методы исследования выполняли на базе Учреждения Российской Академии Наук Института общей генетики им Н.И.Вавилова, лаборатории экологической генетики (заведующий лабораторией д.б.н. Рубанович А.В.). Таблица. 2

Таблица 2. Специальные методы исследования

2.2 Методы генотипирования.

Генотипирование было проведено 274 пациенткам путем постановки реакции на основе взятых анализов периферической крови.

У каждой пациентки осуществляли забор венозной крови в стерильную одноразовую пробирку объемом 5 мл, содержащую консервант – раствор К3EDTA, в соотношении 1:10. Хранение образцов осуществляли при температуре -20˚-80˚C вплоть до постановки реакции.

В ходе исследования выделяли ДНК из образцов крови с использованием наборов реактивов Diatom DNA Prep 200 (Isogene Lab.Ltd,

страна производитель Россия). Постановку реакции осуществляли согласно методу, заявленному производителем.

Для проведения ПЦР реакции использовали лиофилизированные готовые наборы Master Mix (Фирма Изоген). Постановку реакции осуществляли согласно протоколу, заявленному производителем.

2.3 Определение активности катехол-о-метилтрансферазы.

Определение активности фермента катехол-о-метилтрансферазы осуществляли согласно методике, описанной Zurcher.G., 1982г (166).

2.4.Статистическая обработка данных.

Вработе анализировали выборку объемом 274 наблюдений. Каждое наблюдение содержало 89 переменных, из которых 78 признаков являлись дискретными, качественными, а 11 признаков - непрерывными, количественными. Доля пропущенных значений составила менее 1% . Для статистического анализа были использованы следующие методы:

1) Проверка нормальности распределения количественных признаков с использованием критерия Колмогорова-Смирнова (адрес свободного доступа http://www.nsu.ru/mmf/tvims/chernova/ms/lec/node45.html)

2) Для оценки критерия значимости в двух независимых группах,

представленных непараметрическими ранговыми величинами, использовали

48

критерий χ2 (Хиквадрат) и критерий Фишера (пакет программ WinPePi,

адрес свободного доступа http://www.brixtonhealth.com/pepi4windows.html). 3) Для групп, представленных параметрическими величинами,

использовали t-тест Стьюдента

5)В ряде случаев для оценки достоверности различий частот бинарных показателей использовали также трендовый тест Армитажа (адрес свободного доступа http://www.biomedcentral.com/1753-6561/3/S7/S37).

6)Вклады различных генотипов в заболеваемость определяли с помощью традиционного для таких исследований показателя «odds ratio» (пакет программ WinPePi, адрес свободного доступа http://www.brixtonhealth.com/pepi4windows.html). (OR – мера коррелятивной

связи), равного OR Pбол(1 Pздор) ,

Pздор(1 Pбол)

где Pбол - частота генотипа среди больных, Pздор - частота генотипа среди здоровых. При отсутствии корреляций между генотипом и заболеванием OR=1. При OR>1 говорят о повышенном риске заболевания при данном генотипе.

7) Все обследованные популяции были проверены на соответствие критерию Харди-Вайнберга.

8) Оценку корреляционной зависимости для непараметрических ранговых величин проводили по методу Спирмена (R).

Выборочные параметры, приводимые далее в таблицах и рисунках, имеют следующие обозначения: М - среднее, s - стандартное (среднеквадратичное) отклонение, m - ошибка среднего, n - объем анализируемой подгруппы, р - достигнутый уровень значимости. Критическое значение уровня значимости принималось равным 5% .

49

Глава 3. Клиническая характеристика пациенток обследованных групп.

Материалы диссертационной работы получены в результате комплексного клинико-лабораторного обследования 274 женщин.

Основную группу составила 151 пациентка с 2 и более потерями беременности в анамнезе на сроке более 7 недель. Критериями исключения из группы являлись случаи тяжелых аномалий кариотипа (анэмбриония), а также беременности, наступившие в результате ЭКО. Всем пациенткам, включенным в основную группу было проведено кариотипирование абортусов, с целью исключения грубых аномалий кариотипа, как причины потери беременности.

Для контрольной группы было отобрано 123 женщины с 2 и более беременностями в анамнезе, протекавшими без угрозы прерывания и закончившимися срочными самопроизвольными родами. Из группы исключались пациентки с кровяными выделениями во время беременности, а также с эпизодами репродуктивных потерь в анамнезе.

Сбор материала осуществлялся на клинических базах кафедры акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета РНИМУ им. Н.И. Пирогова (заведующий кафедрой заслуженный врач России, д.м.н.,

преимущественно на территории города Москвы и Московской области. Все исследования были проведены с письменного согласия испытуемых женщин. На каждую пациентку была заведена индивидуальная карта, включающая данные анамнеза жизни, характер менструальной функции, наличие гинекологической и экстрагенитальной патологии, перенесенные вирусные и инфекционные заболевания, также подробно выяснялось

50