4 курс / Акушерство и гинекология / Копылова_Ю_В_Роль_проангиогенных_и_антиангиогенных_факторов_в_развитии

квадрантах полости матки. Маловодием считали значение индекса амниотической жидкости менее 10, а многоводием — более 20 см.

Диагностика плацентарной недостаточности основывалась на результатах ультразвукового и допплерометрического исследования:

выявление СЗРП, его формы и степени тяжести, а также выявление нарушений маточно-плацентарного и плодового кровотоков. Для диагностики СЗРП полученные данные фетометрии сравнивали с нормативными показателями для данного срока беременности. При этом выделяли 3 степени СЗРП:

I степень — отставание фетометрических показателей на 2 недели;

II степень - на 3 - 4 недели;

IIIстепень - на 4 недели и более.

Взависимости от пропорциональности отставания разных показателей выделяли симметричную, асимметричную и смешанную формы СЗРП.

Симметричная форма характеризуется пропорциональным отставанием от гестационного срока всех параметров фетометрии.

При асимметричной форме отмечается отставание только окружности живота, БПР и длина бедра остаются в пределах нормативных для данного срока значений.

Для смешанной формы характерно уменьшение всех фетометрических параметров по данным УЗИ с преимущественным уменьшением размеров живота за счет выраженного недоразвития подкожно-жировой клетчатки и объема паренхиматозных органов плода. При этом окружность живота плода отстает от гестационного срока в большей степени, чем размеры головы и бедренной кости

(Бунин М.В., 1994).

Кроме того, учитывали косвенные признаки ПН: маловодие,

эхографические признаки преждевременного созревания плаценты, т.е.

71

выявление второй степени зрелости плаценты ранее 32 недель

беременности и 3 степени - ранее 36 недель.

Допплеровское исследование в маточно-плацентарном

комплексе

При допплерометрическом исследовании гемодинамики в системе мать- плацента-плод проводили качественный анализ кривых скоростей кровотока в следующих сосудах: маточных артериях с двух сторон, артерии пуповины и ее терминальных ветвях, аорте плода, средней мозговой артерии. Допплерометрию сосудов маточно-плацентарно-

плодового звена осуществляли на ультразвуковой установке «Aloka-

4000», снабженной датчиком цветного допплеровского картирования, в отделении пренатальной диагностики ГБУЗ «ГБ №8» ДЗ г Москвы.

Всем беременным при поступлении в стационар проводили допплеровское исследование кровотоков в маточных артериях, артерии пуповины, сосудах плода.

Для анализа кривых скоростей кровотока в исследуемых сосудах производили вычисление общепринятых уголнезависимых показателей: систоло-диастолического отношения (СДО) и индекса резистентности (ИР).

1.Индекс резистентности (ИР, Pourcelot L., 1974 г.): (С-Д)/С

2.Систолодиастолическое отношение (СДО, Stuart B., 1980г.): С/Д С - максимальная систолическая скорость кровотока; Д - конечная диастолическая скорость кровотока;

СДО и ИР по сути одно и то же.

Кривые скорости кровотока получали на протяжении 3 — 5

кардиоциклов и вычисляли усредненные значения показателей. Нарушения гемодинамики в системе мать-плацента-плод

оценивали в соответствии с классификацией, предложенной А.Н. Стрижаковым и соавт. (1986):

72

1А степень - нарушение маточно-плацентарного кровотока при сохранном плодово-плацентарном; 1Б степень - нарушение плодово-плацентарного кровотока при сохранном маточно-плацентарном;

II степень - одновременное нарушение маточно-плацентарного и плодово-плацентарного кровотока, не достигающее критических значений (сохранение положительно направленного диастолического кровотока в артерии пуповины);

III степень - критическое нарушение плодово-плацентарного кровотока

(отсутствие или ретроградное направление конечно-диастолического кровотока) при сохраненном или нарушенном маточно-плацентарном кровотоке.

Кардиомониторное наблюдение за состоянием плода производили при помощи кардиотокографии в сроке 30 недель беременности и более.

Запись осуществлялась в положении беременной на спине или на боку в течение 30 минут. При анализе оценивали базальный ритм, его вариабельность, т.е. амплитуду и частоту мгновенных осцилляций, а

также акцелерации и децелерации. Нестрессовый тест считался положительным в случае регистрации двух и более акцелераций амплитудой не менее 15 ударов в минуту на протяжении 15 минут записи.

Специальные методы исследования

Специальные методы исследования проводили в лаборатории Института биологии гена РАН (Лаборатория генной терапии) при финансовой поддержке ЗАО «Протеинсинтез» (руководитель лаборатории к.б.н. Лысюк Е. Ю.)

Определение уровней про- и антиангиогенных факторов в плазме крови проводили в сроки гестации 28-37 недель.

73

Исследование содержания белков sFlt-1, PlGF и sEng

методом иммуно-ферментного анализа

Исследование проводили с использованием коммерческих наборов фирмы «R&D Systems» (Великобритания), представляющих собой полностью готовые наборы материалов и реагентов для проведения твердофазного «сэндвич» иммуноферментного анализа (ИФА). Иммуноферментный анализ — лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, в основе которого лежит специфическая реакция антиген-

антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала. Из-за разнообразия объектов исследования — от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, и многообразия условий проведения ИФА существует большое количество вариантов этого метода.

В работе использовали набор для анализа sVEGF R-1/Flt-1 (Quantikine Human Soluble VEGF R1/Flt-1 Immunoassay, кат. №DVR100B), набор для анализа PlGF (Quantikine Human PlGF Immunoassay, кат. № DPG00) и набор (Quantikine Human Endoglin/CD105 Immunoassay, кат. № DNDG00) для анализа эндоглина.

Получение сыворотки крови проводили по cтандартной методике. Для получения периферической крови проводили пункцию локтевой лены. Забор крови проводили натощак в одноразовую сухую пробирку. После образования cгустка (инкубировали при комнатной температуре около 15-30 минут) пробирку с кровью центрифугировали в течение 15 мин при 1500g, сыворотку крови отбирали, делили на аликвоты и замораживали. До проведения исследования образцы хранили при температуре -200С. Непосредственно перед работой образцы cыворотки крови размораживали при комнатной температуре.

Иммуноферментный анализ проводили в точном cоответствии с рекомендациями фирмы-производителя.

74

Во все лунки плашки, уже cорбированной антителами к исследуемому маркеру, добавляли по 100 мкл раствора для разведения образцов. После этого в лунки добавляли по 100 мкл растворов cтандартов или предварительно размороженных образцов сыворотки, в

качестве негативного контроля использовали раствор для разведения образцов. После инкубации в течение 2 часов при комнатной температуре на шейкере плашку отмывали и добавляли в лунки по 200

мкл раствора антител к иcследуемому белку, конъюгированных с пероксидазой хрена. После инкубации в указанных выше условиях плашку cнова отмывали и добавляли по 200 мкл смеси красящих растворов и инкубировали в течение еще 30 мин при комнатной температуре в темноте. По иcтечении указанного времени в лунки добавляли по 50 мкл раствора для остановки реакции, сразу после чего проводили измерение оптической плотности на планшетном спектрофотометре Multiskan EX (Labsystems, Финляндия) при длине волны 450 нм с коррекцией оптической плотности при длине волны 540

нм и соотносили значения оптической плотности в лунках с неизвестными образцами с калибровочной кривой, поcтроенной на основании измерения в лунках с контрольными образцами.

Минимально определяемая доза в тесте для sFlt-1 56 пг/мл, для endoglin 56 пг/мл, для PIGF 15 пг/мл.

Методы оценки постнатальных исходов

Состояние новорожденных оценивали c момента рождения. Роды вели с участием квалифицированной бригады неонатологов и реаниматологов. При необходимости реанимационные мероприятия проводили cразу после рождения. Новорожденные находились на лечении в детских отделениях родильного корпуса (детском или отделении реанимации и интенсивной терапии) с последующей

75

выпиской домой или переводом для дальнейшего лечения на II этап

выхаживания или в другие стационары.

Оценку состояния новорожденных проводили по cледующим

параметрам:

Соответствию антропометрических данных гестационному возрасту плода, определяемому по системе перцентильных кривых;

Шкале Апгар на 1-й и 5-й минуте;

Наличию симптомов и степени тяжести острой дыхательной

недостаточности.

Заболеваемость новорожденных анализировали по cледующим

нозологическим формам:

Внутриутробное инфицирование: генерализованная инфекция,

врожденная пневмония, некротический энтероколит;

Синдром дыхательных расстройств по трем cтепеням тяжести (1

степень тяжести – ателектазы, 2 степень тяжести - отечно-

геморрагический синдром, 3 cтепень тяжести – болезнь гиалиновых мембран);

Гипоксически-ишемическое и гипоксически-геморрагическое поражение ЦНС (три cтепени тяжести внутрижелудочкового кровоизлияния и гипоксическое паренхиматозное кровоизлияние в

вещество головного мозга)

Дифференциальную диагностику патологии новорожденных проводили на оcновании клинико-анамнестических данных,

лабораторных методов исследования и рентгенодиагностики.

Статистический анализ

Математическую обработку полученных данных проводили с использованием методов вариационной статистики (пакет Statistica 7. и

MSOfficeExel 2010). Определяли cредние показатели в группах для

76

параметрических критериев, доли - для непараметрических. Сравнение средних оcуществляли с помощью двустороннего t критерия Стьюдента для независимых переменных или с помощью критерия Манна-Уитни

(cравнение групп) в случае выявления отличия распределения от нормального.

Глава III. Методы оценки плацентарной недостаточности с

учетом уровня сосудистых факторов роста.

Для получения информации о функциональных резервах фетоплацентарного комплекса всем пациенткам проводили эхографическое исследование, которое включало в себя плацентографию, фетометрию, оценку околоплодных вод и допплерометрическое исследование.

При проведении плацентографии определяли локализацию плаценты, толщину, расстояние плаценты от внутреннего зева,

соответствие степени зрелости плаценты гестационному сроку,

наличие патологических включений в структуре плаценты.

Преждевременное созревание плаценты достоверно чаще выявляли у беременных основной группы, по сравнению с контрольной:

у 67,2% (78) и 1,9% (1) беременных, соответственно (p<0,05). При этом с утяжелением ПН, частота выявления преждевременного созревания плаценты увеличивалась: с 34,12% (15) в IА подгруппе, к 73,7% (28) в IБ

подгруппе, до 94,1% (32) в IВ подгруппе. Дегенеративные изменения плаценты также достоверно чаще выявляли в IВ подгруппе, по сравнению с IБ и IА подгруппой: в 79,4% (27) случаев, в 44,7 % (16)

случаев и 20,7% (9) случаев, соответственно (p<0,05). Достоверно чаще гипоплазию плаценты диагностировали у пациенток IВ подгруппы, по сравнению с IБ и IА подгруппой: у 70,6% (24), 60,5% (23) и 48,3% (56)

беременных, соответственно (p<0,05). Достоверно чаще гипоплазию

77

плаценты выявляли у беременных IБ подгруппы, по сравнению с IА

подгруппой (p<0,05) (Рис. 6).

Рисунок 10. Данные плацентометрии у беременных основной

группы.

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с беременными IА и IБ подгрупп,

◊ - р<0,05 по сравнению с беременными IАподгруппы.

Гипоплазии плаценты и дегенеративных изменений в плаценте в группе здоровых беременных выявлено не было. Наибольшая частота случаев выявления маловодия наблюдалась в IВ подгруппе у беременных с СЗРП III степени и составила 70,6%(24), что достоверно выше, чем в IБ подгруппе и IА подгруппе, где частота маловодия составляет 58% (22) и 31,8% (14) соответственно (p<0,05). Многоводие определяли у 3,4%(4) беременных основной группы. В группе контроля маловодия и многоводия не выявляли.

Таким образом, с утяжелением степени тяжести ПН и СЗРП нарастает частота патологии плаценты, маловодия и многоводия.

При анализе формы СЗРП у беременных основной группы,

выявлены достоверные отличия. Достоверно чаще асимметричная

78

форма СЗРП по сравнению с симметричной формой наблюдалась у пациенток IА и IБ подгрупп: в 79,5% (35) и 52,6% (20) по сравнению с

20,5% (9) и 47,4% (18) случаев, соответственно (p<0,05). В IВ подгруппе частота выявления симметричной и ассиметричной формы СЗРП достоверно не отличалась и составила 50% (17) и 50% (17) (p<0,05).

Рисунок 11. Форма СЗРП у беременных основной группы.

Допплерометрическое исследование проводили 110 (94,8%)

беременным основной группы и 49 (94,2%) беременным группы контроля. Срок беременности на момент исследования в среднем составил 32,8±0,6 в основной группе и 33,9±1,2 недель в контрольной группе и достоверно не отличался. В IА, IБ и IВ подгруппах основной группы срок гестации в среднем составил 33,1±1,1 недель, 33,5±0,9

79

недель и 31,8±1,5 недель, соответственно, и достоверно не различался.

Кровотоки оценивали в артерии пуповины, аорте, средней мозговой артерии и маточных артериях. Средний показатель систолодиастолического отношения в артерии пуповины был достоверно выше в основной группе, по сравнению с контрольной и составил 2,98±0,21 и 1,95±0,24, соответственно (p<0,05). При сравнении подгрупп основной группы средний показатель систолодиастолического отношения в артерии пуповины достоверно не отличался и составил в

IА, IБ и IВ – 2,9±0,3, 3,2±0,5 и 2,97±0,1, соответственно. Средний показатель систолодиастолического отношения в аорте был достоверно выше у пациенток основной группы (7,1±0,8), по сравнению с контрольной (4,3±0,7), при этом средний показатель СДО в аорте у пациенток IВ подгруппы был достоверно выше, по сравнению с IБ и IВ

подгруппой и составил 8,2±2,8, 6,8±0,7 и 7,03±1,8, соответственно

(p<0,05). Средние показатели СДО в средней мозговой артерии у беременных основной и контрольной групп достоверно не отличались –

4,7±0,7 и 4,9±0,8. Не было выявлено достоверных различий и среди подгрупп основной группы по данному показателю. Средние показатели СДО в правой и левой маточных артериях были достоверно выше у пациенток основной группы при сравнении с контрольной, и составили

2,61±0,3, 2,63±0,3 и 1,9±0,3, 2,0±0,3, соответственно (p<0,05).

Критические кровотоки (нулевой и реверсный) выявляли достоверно чаще у пациенток IВ подгруппы, по сравнению с IБ подгруппой: у 70,6% (24) беременных и 21,1% (8) беременных, соответственно (p<0,05). В IА

подгруппе и группе контроля критические кровотоки не диагностировали.

При анализе степени нарушений кровотоков по данным допплерометрии выявлены достоверные отличия в обследованных группах. Нарушения маточно-плацентарного и внутриплодового кровотоков достоверно чаще выявляли в IВ подгруппе, по сравнению с

80