Основы промышленной асептики лабораторная работа № 1

Тема: МОРФОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КОККОВИДНЫХ И ПАЛОЧКОВИДНЫХ БАКТЕРИЙ -КОНТАМИНАНТОВ СФЕРЫ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА И ГОТОВОЙ ПРОДУКЦИИ

Цель работы: знакомство с организацией микробиологической лаборатории, освоение навыков асептики при работе с микроорганизмами, методов приготовления окрашенных мазков бактерий и их микроскопии.

Вопросы для обсуждения

1. Организация микробиологической лаборатории и правила работы с микроорганизмами.

2. Техника приготовления микробиологических мазков.

3. Простые и сложные методы окраски микроорганизмов. Окраска бактерий по методу Грама.

4. Устройство микроскопа и правила работы с ним.

5. Структура бактериальной клетки.

6. Отношение микроорганизмов к кислороду.

7. Характеристика основных форм неспорообразующих бактерий: кокковидных и палочковидных.

8. Морфология спорообразующих бактерий. Особенности строения эндоспор. Функции спор у бактерий.

Информационный блок

Микроорганизмы – живые организмы, не видимые человеческому глазу; для их рассмотрения требуется специальное оборудование (микроскоп). Экологию микроорганизмов, их строение, особенности жизнедеятельности, взаимодействие с другими организмами изучает наука микробиология. Объектами изучения микробиологии являются бактерии, микроскопические грибы, простейшие животные и вирусы. Ряд микроорганизмов являются опасными контаминантами (от лат. сontaminatio – загрязнение) объектов сферы фармацевтического производства (оборудования, воздуха, персонала и его технологической одежды, поверхностей производственных помещений и др.) и готовой продукции различного происхождения и назначения.

Все живые организмы, в том числе и микроорганизмы, имеющие клеточное строение, можно разделить на прокариоты (от греч. pro – до, перед, karyon – ядро) и эукариоты (от греч. eu – хороший, правильный). Эукариотические организмы (в частности, грибы) имеют оформленное ядро, то есть их генетический материал отделён от цитоплазмы ядерной мембраной. У прокариот (к ним относятся бактерии) оформленное ядро отсутствует, их хромосома находится непосредственно в цитоплазме. Вирусы, в отличие от про- и эукариот, клеточного строения не имеют.

Современная классификация микроорганизмов, имеющих клеточное строение, предполагает деление их на отдельные группы ­– таксоны (от греч. taxis – расположение, порядок). соподчинённые друг другу. Высшим таксономическим уровнем в классификации микроорганизмов является домен, внутри которого выделяют (последовательно):

• для домена Bacteria – филы, классы, порядки, семейства, роды, виды;

• для домена Eukarya – царства, отделы (для грибов), классы, порядки, семейства, роды, виды.

Основной таксономической единицей в микробиологии является вид (лат. species). Для названия видов микроорганизмов используется биноминальная номенклатура, которая включает родовое и видовое названия (первое слово означает название рода, второе – видовой эпитет), например: золотистый стафилококк относится к роду Staphylococcus, виду Staphylococcus aureus. Если видовая принадлежность микроорганизма не конкретизируется, то указывают только род с добавлением sp. (сокращение от species), например Staphylococcus sp. (некий неопределённый вид рода Staphylococcus). Если имеются в виду все (любые) виды рода, то при написании обозначают Staphylococcus spp. При повторном упоминании в тексте название рода сокращается до одной (первой) буквы (S. aureus).

Работа с микроорганизмами проводится в микробиологических лабораториях, которые организуются при предприятиях фармацевтической и пищевой промышленности (для контроля сырья, продукции и других объектов сферы производства), центрах экспертизы и контроля качества различных продуктов, лечебно-профилактических учреждениях, санитарно-эпидемиологических станциях, научно-исследовательских и учебных институтах соответствующего профиля. В состав микробиологической лаборатории входят помещения для микробиологических исследований (посевов, микроскопии), приготовления, разлива и хранения питательных сред для культивирования микроорганизмов, хранения и надевания рабочей одежды, стерилизационные, термостатные, моечные, комнаты для приема и регистрации материала (анализируемых проб), работы с документами и некоторые другие вспомогательные помещения.

Все работы с микроорганизмами должны проводиться в строго асептических условиях. Асептика – это комплекс мероприятий, направленных на предотвращение попадания микроорганизмов в/на объект или из объекта в окружающую среду. Для создания асептических условий при работе с микроорганизмами в лабораториях используются боксы биологической безопасности или спиртовые и газовые горелки, стерильные инструменты и ряд других методических подходов.

Общая характеристика бактерий

Бактерии относятся к прокариотическим организмам. Основными структурными компонентами клетки бактерий являются цитоплазма, в которой находится бактериальная хромосома (нуклеоид) и рибосомы, а также мембранные и поверхностные структуры, прежде всего клеточная стенка. Основой клеточной стенки бактерий является полимер пептидогликан (муреин), состоящий из полисахаридных цепей, связанных между собой пептидными сшивками («мостиками») в единую каркасную структуру («муреиновый мешок»). У части бактерий пептидогликан в клеточной стенке многослойный (может быть до 40 слоёв), в связи с чем при окраске по методу Грама (см. ниже) они будут приобретать сине-фиолетовый цвет и считаются грамположительными. Кроме пептидогликана в клеточной стенке грамположительных бактерий присутствуют небольшие количества других (минорных) компонентов, прежде всего тейхоевых кислот (полимеры многоатомного спирта рибита или глицерина, свзанные между собой остатками фосфорной кислоты) и белков.

У других бактерий (грамотрицательных) пептидогликана в клеточной стенке значительно меньше (1–2 слоя), зато сама стенка устроена сложнее и содержит (кроме муреина) также липополисахариды, фосфолипиды, липопротеины и белки. Липополисахариды грамотрицательных бактерий обладают значительной токсичностью (эндотоксины) и, попав в макроорганизм (в кровяное русло), могут вызвать пирогенную реакцию (от греч. pyr – огонь, жар).

Для окраски микроорганизмов, в том числе бактерий, используют простые и сложные методы. Простые методы окраски предполагают использование одного красителя (например, метиленового синего или водного фуксина), при этом все клетки окрашиваются в одинаковый цвет. Такой подход используется для определения формы клеток, их размеров и взаимного расположения. При сложных методах окраски используют несколько красителей и реактивов, что позволяет дифференцировать микроорганизмы по определенным признакам, а также изучать особенности структуры клеток.

Наиболее широко используемый сложный метод окраски бактерий был предложен датским микробиологом Х. Грамом. Метод основан на различиях в строении клеточной стенки бактерий. На первом этапе окраски фиксированный мазок обрабатывают водным раствором красителя генцианового фиолетового (генцианвиолета), который диффундирует через клеточную стенку и окрашивает бактерии в сине-фиолетовый цвет. Затем добавляют раствор йода (раствор Люголя), также проникающий внутрь клетки. В периплазматическом пространстве образуется комплекс генцианвиолета с йодом, который имеет сине-фиолетовый цвет, нерастворим в воде и мало растворим в этаноле. Дальнейшая обработка этанолом позволяет легко удалить этот комплекс из клеток бактерий, в клеточной стенке которых мало (1–2 слоя) пептидогликана, при этом клетки полностью обесцвечиваются. У бактерий, имеющих в стенке многослойный пептидогликан, комплекс задерживается, и клетки остаются сине-фиолетовыми. На последнем этапе производится докрашивание водным фуксином. Обесцвеченные этанолом клетки приобретают розовый или красный цвет (грамотрицательные бактерии), а клетки грамположительных бактерий сохраняют сине-фиолетовый цвет.

По отношению к молекулярному кислороду выделяют следующие основные группы микроорганизмов, в том числе бактерий:

 облигатные (строгие) аэробы, которые могут жить и размножаться только в присутствии молекулярного кислорода;

 облигатные анаэробы, которые могут расти только в среде без кислорода;

 факультативные анаэробы могут существовать как в присутствии, так и в отсутствии кислорода.

Основные морфологические группы бактерий

Наиболее распространёнными морфологическими группами бактерий являются кокковидные, палочковидные, изогнутые, извитые, нитевидные (в том числе мицелиальные).

1. Кокки (от греч. kókkos – зерно) – бактерии округлой формы, чаще всего имеют диаметр 0,5–2 мкм. Отдельные клетки кокков могут иметь шаровидную, овальную, бобовидную («кофейное зерно») или ланцетовидную форму. В зависимости от взаимного расположения клеток различают (рис. 1):

– микрококки (одиночные клетки);

– диплококки (расположение по 2 клетки);

– стрептококки (от греч. streptós – цепочка) – цепочки клеток;

– тетракокки (по 4 клетки);

– сарцины (от лат. sarcina – связка, пакет) – скопления в виде кубиков;

– стафилококки (от греч. staphylē – гроздь) – скопления в виде виноградной грозди (при беспорядочном делении в 2–3 взаимно перпендикулярных плоскостях).

Рис.1. Кокковидные бактерии: А – стафилококки (Staphylococcus aureus); Б – тетракокки (Micrococcus luteus); В – стрептококки (Streptococcus pyogenes); Г – диплококки (Neisseria sp.); Д – сарцина.

Кокки, в основном, неподвижны. Клетки некоторых кокков имеют капсулы, состоящие из полисахаридов и защищающие клетки от высушивания. У патогенных бактерий капсула является фактором патогенности, препятствуя фагоцитозу.

Большинство кокков окрашивается по методу Грама положительно, однако есть и грамотрицательные кокки.